一氧化氮對金黃色葡萄球菌生物膜影響的研究.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物體內(nèi)重要的活性分子。NO參與了生物體內(nèi)細胞的分化和凋亡、血管松弛、神經(jīng)傳遞、免疫防御反應以及種子萌發(fā)、下胚軸伸長、葉擴展、根生長等許多重要生理過程，被認為是多功能的第二信使。NO在動物體和高等植物中的研究早已受到廣泛的重視，但是NO在細菌中，尤其是在細菌形成的多細胞結構一細菌生物膜(biofilm)中的作用卻極少有人研究。細菌生物膜是由細菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細

2、胞結構，是細菌產(chǎn)生抗生素耐藥和逃避機體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是院內(nèi)感染的重要病原體之一，其致病機理與其生物膜的生成密切相關。本論文旨在研究NO對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，為進一步研究NO在生物膜中的作用和機制奠定了基礎。 首先，利用實時熒光定量PCR檢測了S.aureus生物膜和浮游細菌中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)基因nos的mRNA表達水平，結果

3、表明生物膜中nos的表達量明顯高于浮游菌，表明NO可能對生物膜的形成具有重要作用。為了檢測NO對生物膜的影響，通過外源加入NO供體SNP和NO清除劑PTIO觀察細菌生物膜的變化。結果表明SNP能夠明顯促進S.aureus生物膜的生長，而加入NO清除劑PTIO后能夠抑制SNP引起的生物膜的增加。 為了進一步研究NO對生物膜的影響，利用同源重組方法構建了S.aureusnos基因缺失突變株。在突變株的構建過程中，我們發(fā)現(xiàn)由于S.au

4、reus細胞壁厚而致密而且穿梭重組質(zhì)粒較大，使用目前的常規(guī)轉化方法無法導入外源性DNA，限制了遺傳操作的進行。為了提高轉化效率，我們利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶或TritonX-100在電擊轉化前對細菌進行預處理，使轉化效率顯著提高，最高達到1.7×103cfu/μgDNA，從而建立了一種簡便、高效的轉化方法。同源重組載體pMAD△nos的構建是將PCR獲得的nos基因上下游同源序列和壯觀霉素抗性基因連入穿梭載體pMAD。pMAD△nos載

5、體首先轉入S.aureus RN4220，經(jīng)修飾后轉入S.aureus RN6390，利用溫度敏感性和抗生素抗性篩選同源重組體，成功構建了S.aureus RN6390 nos基因缺失突變株。生物膜形成實驗表明nos缺失突變株的生物膜形成能力明顯減弱，其生物膜的量比野生型減少了30％以上；最低生物膜消除濃度(MBEC)試驗表明突變株生物膜對抗生素的敏感性提高為野生型的兩倍。 綜上所述，本論文建立了一種簡便高效的S.aureus外