基于RARα-HDAC雙靶點抗癌藥物的設(shè)計、合成與生物活性研究.pdf

1、1.立題背景
　　 長期以來，白血病一直是威脅人類生命健康的惡性血液疾病，并且隨著工業(yè)化進程的發(fā)展、環(huán)境的惡化，誘發(fā)白血病的外因逐漸增多，使得白血病的發(fā)病率特別是兒童白血病的發(fā)病率呈上升趨勢。
　　 隨著分子生物學、細胞生物學的發(fā)展，白血病的發(fā)病機制研究不斷深入，染色體易位、原癌基因及抑癌基因的變異是白血病發(fā)病的主要原因，信號通路等的改變對白血病的進程有直接的影響，但由于不同類型的白血病發(fā)病機制的差異，造成白血病治療的復

2、雜性及多變性。
　　 維甲酸類化合物是4000余個天然及合成化合物的總稱，其中多種化合物已成為腫瘤治療的一線用藥，如全反式維甲酸(ATRA)通過誘導細胞分化作用而成為復發(fā)或難治性急性早幼粒細胞白血病(APL)治療的首選及一線用藥;他米巴羅汀(Tamibarotene，AM80)，是特異性RARα激動劑，臨床主要用于治療各種類型的APL，由日本NipponShinyaku公司開發(fā)，2005年6月在日本首次上市(商品名:Amnola

3、ke)。
　　 組蛋白去乙?；?HDAC)通過參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而與白血病及其它惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤治療中一類較新的作用靶點:通過核受體，HDAC可被募集至腫瘤細胞中，使腫瘤細胞中HDAC呈高表達，其后果包括:細胞中基因的正常轉(zhuǎn)錄因此受到抑制，最終導致腫瘤的發(fā)生;其次，白血病及其它惡性腫瘤中往往存在細胞的異常增殖及分化受阻，這與影響細胞生長及分化的相關(guān)蛋白的靜默相關(guān)，而這些蛋白的靜默是啟動子區(qū)域DNA的異常甲基化

4、，以及包含組蛋白去乙酰化在內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的結(jié)果。這種HDAC與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展間的相關(guān)性是尋找及研究組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)的理論基礎(chǔ)。組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)按結(jié)構(gòu)特點共分6大類，目前已有部分組蛋白去乙酰化酶抑制劑被批準上市，還有10多個處于臨床試驗階段。組蛋白去乙?；敢种苿┠軌蚓徑馓囟ㄖ掳┗虍a(chǎn)物引起的轉(zhuǎn)錄抑制，已證實在白血病及其它惡性腫瘤的治療中具有確切的療效，其對白血病的治療機制主要包括:

5、誘導細胞分化，特別是對ATRA產(chǎn)生耐藥的病人尤其顯著:HDACIs通過抑制HDAC活性，消除特定靶細胞組蛋白去乙酰化，使得白血病細胞恢復對ATRA的敏感性;其它作用機制還包括誘導白血病細胞的凋亡及抑制增殖;細胞周期阻滯等等。組蛋白去乙?；敢种苿┑膬?yōu)點在于，靶向性較好，相應地毒副作用較小，缺點是生物利用度低、代謝快。目前已有多個HDACIs進入臨床試驗階段，SAHA是FDA批準的第一個上市的HDACIs。
　　 2.目標化合物的

6、設(shè)計
　　 對已有的HDACIs結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，HDACIs的結(jié)構(gòu)一般由三部分組成:疏水性基團、連接基團及鋅離子螯合基團?；谝阎狧DAC抑制劑（如SAHA）的三維結(jié)構(gòu)及其與酶的結(jié)合模型，根據(jù)藥物設(shè)計的拼合原理，同時借鑒前藥及多靶點藥物理論，本文以RARα選擇性激動劑他米巴羅汀(AM80)為疏水性基團，以異羥肟酸、羧基等作為鋅離子螯合基團，通過酯鍵或酰胺鍵（連接基團）將二者融合，設(shè)計合成了一系列結(jié)構(gòu)全新的HDAC抑制劑。目標化

7、合物進入到體內(nèi)后，通過抑制HDAC的活性，從而抑制白血病細胞的增殖、促進其分化和誘導其凋亡，同時，其在體內(nèi)酯酶或酰胺酶催化下可代謝釋放出AM80，AM80作用于RARα受體而誘導白血病細胞的分化和抑制其增殖而發(fā)揮白血病治療作用，實現(xiàn)與前體藥物的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。
　　 3.目標化合物的合成
　　 本研究以2，5-二甲基-2，5-己二醇為起始原料，經(jīng)過鹵代、付-克烷基化、硝化、催化氫化、?；?、縮合反應，然后經(jīng)酯水解反應得到關(guān)鍵

8、中間體他米巴羅汀(AM80)。最后他米巴羅汀與鄰苯二胺，鹽酸羥胺，羥基乙酸，甘氨酸等進行近一步的縮合得到目標化合物。目標化合物和具有全新結(jié)構(gòu)的中間體化合物采用H-NMR、ESI-MS譜進行了結(jié)構(gòu)確證。
　　 4.目標化合物生物活性評價
　　 對所合成化合物進行了體外的初步活性評價。體外抑酶試驗中，采用HDAC（HDAC試劑盒、Hela細胞提取物和HDAC-8）、氨肽酶-N和明膠酶三種酶分別進行活性篩選。驗結(jié)果表明所有的目

9、標化合物對HDAC有選擇性抑制作用，其中化合物10b和12b對HDAC的抑酶活性與陽性對照SAHA相當。體外細胞實驗通過MTT法測定了化合物10b和12b對人卵巢透明細胞癌ES-2，人結(jié)腸癌細胞株HCT116，人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，人慢性粒細胞白血病細胞株K562，人急性早幼粒白血病細胞株HL-60和NB4以及人前列腺癌細胞株P(guān)C-3的增殖抑制活性。結(jié)果表明化合物10b和12b對ES-2細胞、PC-3細胞、K562細胞及H

10、L-60細胞的抑制活性均優(yōu)于陽性對照SAHA，對HCT116細胞、MDA-MB-231細胞及NB4細胞的抑制活性均略弱于陽性對照SAHA。10b對HL-60及NB4細胞的抑制活性明顯優(yōu)于對照組AM80，12b對NB4細胞的抑制活性亦明顯優(yōu)于AM80。
　　 5.藥動學研究
　　 選取具有較好抑酶活性和增殖抑制活性的目標化合物12b和10b，以已批準上市的RARα受體選擇性激動劑AM80為陽性對照藥，采用口服和靜脈注射兩種

11、給藥途徑研究了目標化合物在Wistar大鼠體內(nèi)的藥物動力學特性。結(jié)果顯示，靜注給藥后，10b在血漿中以獨立分子存在，5min至11h可持續(xù)釋放出AM80，并且10b作為AM80的前體藥物，與AM80單獨給藥相比，各藥動學參數(shù)均有較大改變，如使AM80的MRT從4.44h延長到18.09h，t1/2從2.22h延長到3.88h，Tmax也從0.08h延長到4h，這些結(jié)果顯示10b靜注可以很好地和其前體藥物發(fā)揮協(xié)同治療作用。與靜注給藥相比，

12、10b和12b口服給藥均顯示較低的生物利用度，血漿中僅檢測到少量的前體藥物及AM80。
　　 6.總結(jié)與展望
　　 本研究以他米巴羅汀為基本結(jié)構(gòu)骨架設(shè)計合成了19個目標化合物，并對其進行了體外初步活性評價。其中，化合物10b和12b在體外表現(xiàn)出較好的抑酶活性及對多株腫瘤細胞很強的增殖抑制活性。體內(nèi)藥動學研究結(jié)果表明目標化合物可代謝釋放出AM80，與其前體藥物HDAC抑制劑形成協(xié)同治療、調(diào)節(jié)作用，使其具有多靶點效應。這些化