5-羥色胺對奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)增殖凋亡及酪蛋白合成的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、5-HT被認(rèn)為是一種反饋性抑制泌乳和誘導(dǎo)乳腺退化的關(guān)鍵因子，但是其對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制尚不明確。奶牛乳腺表達(dá)多種亞型的5-HT受體(HTR1B，2A，2B，4和7)，選擇性阻斷HTR1B和HTR2A引起乳蛋白表達(dá)量升高，但其作用機(jī)制目前亦未見報道。本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T細(xì)胞系）為模型，明確5-HT對細(xì)胞增殖凋亡的影響，初步探明其作用機(jī)制，并探尋5-HT調(diào)控乳蛋白合成的信號通路。
　　首先對MAC-T

2、細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)及鑒定。觀察其形態(tài)為“cobblestone”結(jié)構(gòu)，生長曲線呈“S”形，反復(fù)傳代和凍存，細(xì)胞形態(tài)、功能穩(wěn)定并保持旺盛增殖活力，并表達(dá)上皮細(xì)胞骨架蛋白—角蛋白18。用PRL和INS處理，在mRNA和蛋白水平均檢測到酪蛋白的表達(dá)。利用RT-PCR技術(shù)檢測到5-HT合成限速酶TPH1，以及1B、2A、2B、4、7、5A、3A、1F、1D、2C、1E、1A等多種亞型5-HT受體的表達(dá)，表明MAC-T細(xì)胞為具有分泌活性的奶牛乳腺上

3、皮細(xì)胞，能夠合成5-HT并表達(dá)多種亞型的5-HT受體，適合作為本研究的模型。
　　為明確5-HT對MAC-T細(xì)胞增殖與凋亡的影響，本試驗(yàn)用不同濃度5-HT處理MAC-T細(xì)胞12h，24h，48h，72h，利用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)短時間(12h，24h，48h)5-HT處理，促進(jìn)MAC-T細(xì)胞的增殖。而長時間(72h)5-HT處理抑制了MAC-T細(xì)胞的增殖。選擇性5-HT2B(SB204741)、5-HT2A(R

4、itanserin)、5-HT4(SB204070)、5-HT7(Pimozide)、5-HT1B(SB224289)受體拮抗劑處理MAC-T細(xì)胞24h，測定細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)選擇性5-HT1B、4受體拮抗劑對5-HT誘導(dǎo)的MAC-T的增殖具有明顯的抑制作用。而選擇性5-HT2A、2B、7受體拮抗劑對5-HT誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞的增殖無影響。利用200μM5-HT處理細(xì)胞72h，20μM5-HT處理細(xì)胞24h，RT-qPCR法檢測增殖凋

5、亡相關(guān)因子caspase3、caspase8、Bax、Bcl-2的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)200μM5-HT處理細(xì)胞72h，顯著抑制Bcl-2 mRNA表達(dá)，顯著提高caspase3、caspase8的mRNA表達(dá)量，并引起B(yǎng)ax/Bcl-2值升高。而20μM5-HT處理MAC-T24 h，Bax/Bcl-2的值與對照組相比降低，caspase3 mRNA表達(dá)量顯著降低。這些結(jié)果提示5-HT可通過改變Bax/Bcl-2的比值以及caspase3

6、、caspase8的表達(dá)量來調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn)。
　　為探尋5-HT調(diào)控酪蛋白合成的信號通路，本試驗(yàn)利用20μM5-HT處理細(xì)胞48h，RT-qPCR法測定參與乳蛋白合成調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子JAK2、STAT5、mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E的相對表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-HT處理后STAT5的表達(dá)顯著降低，JAK2有降低的趨勢。但4EBP1、eIF4E、eEF2、mTOR、rpS6K1 mRNA的相對表達(dá)量均不

7、受影響。這提示JAK2-STAT5信號通路參與5-HT對酪蛋白合成的調(diào)控過程。
　　總之，低濃度短時間5-HT處理可以促進(jìn)MAC-T的增殖，高濃度長時間5-HT處理抑制MAC-T的增殖。5-HT對MAC-T增殖的誘導(dǎo)作用是通過1B、4亞型受體，而非2A、2B和7受體來實(shí)現(xiàn)的。5-HT可通過改變caspase3、caspase8表達(dá)、Bax/Bcl-2的值來調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡。JAK2-STAT5信號通路參與5-HT對酪蛋白合成的調(diào)