miR-29家族對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳調(diào)控機制的研究.pdf

1、乳品產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展及人們生活水平的不斷進步，使乳制品消費市場不斷擴大，怎么進一步提升乳產(chǎn)量和優(yōu)化乳品質(zhì)已經(jīng)成為了當(dāng)今奶業(yè)研究的重點。微小RNA(miRNA)是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA分子。在動物中，miRNA與其靶基因的3'UTR區(qū)互補結(jié)合時抑制其翻譯或特異性切割靶mRNA使其降解從而調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA在個體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化中發(fā)揮重要作用，不少研究表明miRNA在哺乳動物乳腺發(fā)育和泌乳中具有重要調(diào)控功能。<

2、br>　　表觀遺傳作為目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，已有研究證明它在乳蛋白基因的表達(dá)及動物乳腺發(fā)育和重塑的過程中具有重要的調(diào)控作用。DNA甲基化作為主要的表觀遺傳修飾方式之一，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，CpG二核苷酸的胞嘧啶環(huán)5'位的氫被S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代變成5'-甲基胞嘧啶，通過這種作用機制在不改變DNA堿基序列的情況下調(diào)控基因在組織和細(xì)胞中的表達(dá)。在哺乳動物中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括DNMT1、DNMT

3、3A和DNMT3B，其中DNMT3A和DNMT3B具有從頭甲基化活性，不需要母鏈的指導(dǎo)，可在未甲基化的DNA雙鏈上進行甲基化，在基因組DNA甲基化異常的發(fā)生中具有重要的引導(dǎo)作用。DNA甲基化參與許多重要生理及病理現(xiàn)象的調(diào)控，有研究表明在奶牛乳腺中DNA甲基化與乳蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，這就為乳腺發(fā)育、泌乳功能機理研究提供了新的方向。
　　miRNA對DNA甲基化模式的調(diào)控多數(shù)集中在腫瘤等疾病的研究上，在奶牛乳腺中還鮮見報道。本

4、課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA在高、低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)具有顯著差異，在高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中上調(diào)的miRNAs中，miR-29s家族(miR-29a、miR-29b、mir-29c)與在DNA甲基化中起關(guān)鍵作用的DNA甲基化酶DNMT3A和DNMT3B的3'UTR有互補序列，miR-29s是否能通過調(diào)控制DNA的甲基化進而影響奶牛乳腺發(fā)育和泌乳功能就成為了我們研究的重點。
　　本研究以本實驗室原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(D

5、CMECs)為模型，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29smimics/inhibitor，首先利用雙熒光素酶活性檢測及綠色熒光蛋白GFP表達(dá)檢測進行了miR-29s靶基因的驗證;應(yīng)用實時熒光定量及Western blotting技術(shù)檢測DNMT3A/3B及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的變化;采用重亞硫酸鹽測序技術(shù)(BSP)分析了泌乳相關(guān)基因的啟動子甲基化的改變;通過細(xì)胞中添加甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dc后觀察了泌乳相關(guān)基因及miR-29s

6、表達(dá)的變化;使用CASY細(xì)胞活力分析儀檢測活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的變化;應(yīng)用EdU標(biāo)記技術(shù)檢測了對細(xì)胞增殖的影響;同時使用酪蛋白檢測試劑盒、TG檢測試劑盒和乳糖檢測試劑盒檢測了細(xì)胞分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的能力。實驗結(jié)果表明:
　　(1)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果與小RNA測序結(jié)果基本一致，顯示高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中miR-29s的表達(dá)與低乳品質(zhì)及非泌乳奶牛乳腺組織相比均顯著升高(P＜0.05)。
　　(2)靶基因驗證實驗

7、表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，DNMT-3A/-3B是miR-29s的靶基因，miR-29s能通過負(fù)調(diào)控DNMT3A/3B的表達(dá)降低細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平(GDM)及甲基轉(zhuǎn)移酶的活力。
　　(3)熒光定量PCR及Western Blotting檢測結(jié)果顯示，miR-29s能影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中泌乳相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)。過表達(dá)miR-29s時奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的AKT1、mTOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1

8、、PPARγ、GLUT1表達(dá)量均顯著下降;抑制內(nèi)源性miR-29s表達(dá)時，細(xì)胞內(nèi)AKT1、mTOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1、PPARγ、GLUT1的表達(dá)均升高;推測miR-29s對乳成分的合成及分泌具有重要的調(diào)控作用。
　　(4)重亞硫酸鹽測序結(jié)果表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中沉默miR-29b時，Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平均有明顯的升高，而Akt1及mTOR

9、啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平?jīng)]有明顯變化。5-Aza-dc處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，熒光定量PCR檢測Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1、Akt1、mTOR mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5-Aza-dc處理組與空白對照組相比Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1的mRNA表達(dá)顯著升高，Akt1、mTOR mRNA的表達(dá)無顯著變化。實驗結(jié)果表明miR-29s主要通過調(diào)控DNA甲基化模式影響泌乳重要基因

10、Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1的表達(dá)，對Akt1、mTOR的調(diào)控機制還需要進一步研究。
　　(5)用5-Aza-dc處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，與空白對照組相比miR-29a、miR-29c的表達(dá)變化并不明顯，miR-29b的表達(dá)顯著升高。重亞硫酸鹽測序結(jié)果表明，與空白對照組相比，miR-29b啟動子區(qū)域甲基化明顯升高。結(jié)果表明在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)受到DNA甲基化水平的調(diào)控。
　

11、　(6)應(yīng)用CASY及EdU標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-29s對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力、細(xì)胞增殖均具有促進作用。檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白(CSN2)、乳糖及甘油三酯的結(jié)果表明，超量表達(dá)miR-29a、-29b、-29c能促進乳蛋白、乳脂及乳糖的合成;沉寂miR-29s對奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的分泌均有抑制作用，且5-Aza-dc能恢復(fù)或部分逆轉(zhuǎn)miR-29s抑制子對乳成分合成的抑制作用，提示miR-29s對奶牛乳

12、腺泌乳的調(diào)控與DNA甲基化作用密切相關(guān)。
　　綜上，miR-29a、miR-29b、miR-29c為乳腺泌乳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的成員，通過調(diào)控其靶基因Dnmt3a/3b的表達(dá)影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞DNA甲基化水平。泌乳相關(guān)基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平的改變能引起基因表達(dá)的變化，進而影響乳腺細(xì)胞的增殖和乳成分的生成及分泌。miR-29s通過調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞DNA甲基化參與乳腺泌乳調(diào)控的作用機制的闡明為今后奶牛業(yè)乳品質(zhì)的優(yōu)化及乳腺泌乳生物