Sulfiredoxin-1經Nrf2-ARE通路保護PC12細胞氧化損傷的機制研究.pdf

1、腦卒中等腦缺血性疾病有著居高不下的發(fā)病率、致殘率與死亡率，給社會造成嚴重的社會經濟學代價。腦缺血再灌注使機體產生氧化應激，造成活性氧產生與機體的內源性抗氧化防御系統(tǒng)清除能力的平衡失調。
　　內源性小分子抗氧化蛋白，Sulfiredoxin-1，屬于Sulfiredoxin(Srx)抗氧化蛋白家族的成員。有研究表明處于氧化/抗氧化失衡狀態(tài)的慢性肺部阻塞性疾病患者的肺組織中，內源性抗氧化酶Srxn1的表達極低，而過表達Srxn1可以保

2、護肺臟組織免受氧化攻擊損傷，也可以保護皮質神經元與星形膠質細胞免受過氧化物的氧化性損傷。本課題擬采用干擾Srxn1基因表達，在體外以H2O2誘導PC12細胞氧化損傷模擬神經元在腦缺血再灌注中的氧化損傷，探討Sulfiredoxin-1對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷的保護作用及其可能機制。
　　方法:
　　(1)應用脂質體轉染技術將Srxn1基因干擾質粒及陰性對照質粒瞬時轉染至PC12細胞中，倒置熒光顯微鏡觀察轉染效率，

3、以β-actin為內參，Western blot方法檢測Srxn1蛋白水平的表達，半定量檢測Srxn1mRNA水平的表達，確認干擾效率。
　　(2)以H2O2濃度為0、180μmol/L的培養(yǎng)液作用于各組細胞24h后，MTS方法檢測各組細胞存活率。
　　(3)H2O2處理各組細胞后，破碎各組細胞，收集樣本，按試劑盒說明書，檢測MDA含量。
　　(4)H2O2處理各組細胞后，分別提取細胞核蛋白與細胞漿蛋白，以β-acti

4、n為胞漿內參，Lamin A為胞核內參，用Western blot方法檢測Nrf2、actin蛋白水平。
　　(5)H2O2處理各組細胞后，分別提取各組細胞總蛋白與總RNA，以β-actin為內參，半定量PCR檢測HO-1、NQO1mRNA水平，Westernblot檢測蛋白水平。
　　結果:
　　(1)成功轉染攜帶siRNA的Srxn1干擾質粒與陰性質粒，RT-PCR及Western blot證實Srxn1干擾組的S

5、rxn1 mRNA及蛋白表達水平與未轉染組與陰性轉染組比較明顯減低，未轉染組與陰性轉染組表達無差異。
　　(2)細胞生存率(％):PC12細胞經200μM的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，與正常對照組相比，細胞活力下降，而干擾Srxn1可以加重這一損傷。
　　(3)MDA含量(nmol/mgpro):各組細胞暴露于含H2O2的培養(yǎng)液12h后，檢測MDA含量均增加，Srxn1干擾組（5.507±0.29）的MDA水平高于未轉染組與

6、陰性載體組，未轉染組與陰性載體組相比差異不顯著（P＞0.05）。
　　(4)Nrf2蛋白水平表達:H2O2損傷后，各組細胞胞漿內Nrf2蛋白水平表達下降，而Srxn1干擾組的這一下降趨勢要弱于未轉染組與陰性載體組。而各組細胞在H2O2損傷后細胞核內的Nrf2蛋白水平表達升高，Srxn1干擾組Nrf2蛋白水平表達較未轉染組與陰性載體組要低(P＜0.05)。
　　(5)actin蛋白水平表達:H2O2處理后，各組細胞胞漿內act

7、in蛋白水平表達下降，而Srxn1干擾組的這一下降趨勢要弱于未轉染組與陰性載體組。而各組細胞在H2O2損傷后細胞核內的actin蛋白水平表達升高，Srxn1干擾組的actin蛋白水平表達較未轉染組與陰性載體組要低(P＜0.05)。
　　(6)HO-1的表達:各組細胞暴露于H2O212h后，HO-1 mRNA的表達在未轉染組(0.729vs.0.458)、陰性轉染組(0.625 vs.0.463)及Srxn1干擾組(0.53 vs.

8、0.478)均較損傷前明顯升高，而Srxn1干擾組這一趨勢明顯低于其他兩組(p＜0.05)，未轉染組與陰性轉染組比較無差異（P＞0.05）。與H2O2損傷前相比，HO-1的蛋白水平表達在未轉染組(1.107 vs.0.63)、陰性轉染組(1.019 vs.0.581)及Srxn1干擾組(0.754vs.0.644)均明顯升高，而Srxn1干擾組的升高明顯低于其他兩組(P＜0.05)，未轉染組與陰性轉染組比較無差異（P＞0.05）。

9、>　　(7)NQO1的表達:H2O2損傷后，Srxn1干擾組的NQO1 mRNA表達水平較損傷前升高（0.827 vs.0.557），未轉染組(0.868 vs.0.547)與陰性載體組(0.915 vs.0.566)同樣升高，但損傷后Srxn1干擾組較未轉染組與陰性載體組明顯降低(P＜0.05)，而未轉染組與陰性載體組比較無差異(P＞0.05)。H2O2損傷后Srxn1干擾組的NQO1蛋白水平與未轉染組與陰性載體組相比明顯較低(P＜0