黃皮果抗氧化有效成分的篩選和對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、[目的]：
　　通過(guò)前期的黃皮果單體化合物的提取制備以及其有效成分結(jié)構(gòu)鑒定，采用H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞模型篩選10種黃皮果單體化合物的抗氧化損傷活性成分，考察黃皮果活性單體對(duì)H2O2引起的PC12細(xì)胞凋亡及相關(guān)藥理學(xué)指標(biāo)的影響，并探討黃皮果有效成分對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。
　　[方法]：
　　首先，培養(yǎng)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)，H2O2（100μmol/L，2小時(shí)）誘導(dǎo)損傷建立細(xì)胞氧化損傷模型

2、，再檢測(cè)PC12細(xì)胞的存活能力，對(duì)10種黃皮果單體化合物抗細(xì)胞氧化損傷的效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選表現(xiàn)抗氧化損傷的有效活性單體，則通過(guò)Rhodamine123熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位（△Ψm）的變化、DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成和AnnexinⅤ熒光探針檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡指標(biāo)來(lái)分析探討黃皮果活性單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用;進(jìn)一步用Western Blot法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)caspase-3.NF

3、-kB，Bax，Bcl-2相關(guān)蛋白的表達(dá)，初步確定黃皮果活性單體對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。
　　[結(jié)果]：
　　通過(guò)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型初步篩選具有神經(jīng)保護(hù)活性單體成分，從10種黃皮果單體化合物成分中評(píng)價(jià)篩選發(fā)現(xiàn)1種具有神經(jīng)保護(hù)活性的單體:槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷各濃度組能提高H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型存活率，其中作用2個(gè)小時(shí)25μg/ml的槲皮素-3

4、-O-β-L-葡萄糖苷組提高細(xì)胞存活率19.386％(P＜0.05)，比25μg/ml木犀草素-4'-O-β-D-葡萄糖苷(3)15.39％、6'-O-硬脂酰-β-D-葡糖基-β-谷甾醇(15)13.63％和正廿六碳烷-1-醇(19)17.53％都高，而有6種黃皮果單體化合物對(duì)PC12細(xì)胞有損傷作用:7-[(Z)-3，4-二羥基-3-苯基丙烯酰-秦皮乙素(6)(25μg/ml)在24h的細(xì)胞存活率為64.66％;6，7-二羥基-2 H-

5、丙氧基-酮(8)(25μg/ml)在24h的細(xì)胞存活率為93.00％;蘆丁(1)(25μg/ml)在48h的細(xì)胞存活率為77.17％;(Z)-3-（4-羥苯基）丙烯酸(10μg/ml、25μg/ml)在24h的細(xì)胞存活率分別為91.09％，89.09％，十六碳酰氯-1-醇(20)(25μg/ml)在24h的細(xì)胞存活率為73.56％;胡蘿卜苷(14)（4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml）在24h的細(xì)胞存活率分別為56.04％、5

6、1.87％、50.70％，可以看出7-[(Z)-3，4-二羥基-3-苯基丙烯酰-秦皮乙素(6)、6，7-二羥基-2H-丙氧基-酮(8)、(Z)-3-（4-羥苯基）丙烯酸(10)、十六碳酰氯-1-醇(20)、胡蘿卜苷(14)的細(xì)胞存活率在24h或者48h都低于正常組（P＜0.01），特別在25ug/ml劑量時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞有毒性。
　　在此基礎(chǔ)上探討槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-L

7、-葡萄糖苷抑制H2O2導(dǎo)致的活性氧族物質(zhì)的產(chǎn)生(reactiveoxygenspecies，ROS)，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系?；钚匝?ROS)染色結(jié)果顯示:模型組的熒光強(qiáng)度比較強(qiáng)，高于正常組的熒光強(qiáng)度（P＜0.05），加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的熒光強(qiáng)度均低于模型組(P＜0.05)。加藥組隨著濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?DCFH-DA熒光探針流式結(jié)果顯示:正常組的活性氧水平為10.5％，模型組的活性氧水平為8

8、0.4％，加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的活性氧水平分別為64.6％、56.2％、52.8％。加藥組隨著濃度的增加，活性氧水平逐漸下降;
　　Rhodamine123探針檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷可以抑制H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電位降低，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系:模型組的熒光強(qiáng)度比較暗，低于正常組的熒光強(qiáng)度（P＜0.05），表明H2O2可降低PC12細(xì)胞的△Ψm，加藥組(4μg/ml、1

9、0μg/ml、25μg/ml)的熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于模型組(P＜0.05)。加藥組隨著濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng);在AnnexinⅤ染色熒光中觀察到，槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑制H2O2導(dǎo)致的凋亡，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系:模型組的熒光強(qiáng)度比較亮，高于正常組的熒光強(qiáng)度(P＜0.05)，加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的熒光強(qiáng)度均低于模型組(P＜0.05)。加藥組隨著濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?進(jìn)一步用Wester

10、n blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白發(fā)現(xiàn):槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑制受H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的caspase-3活性升高，Westem blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組的Caspase-3表達(dá)量比較高（P＜0.05），加藥組（4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml）的Caspase-3蛋白的表達(dá)量均低于模型組(P＜0.05)，加藥組隨著濃度的增加蛋白表達(dá)逐漸下降;而且，槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑

11、制受H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的Bax/Bcl-2比率的升高，與正常組相比，模型組的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量比較高(P＜0.05)，加藥組（4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml）的Bax/Bcl-2比率均低于模型組(P＜0.05)，加藥組隨著濃度的增加蛋白表達(dá)逐漸下降。
　　此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷抑制受H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的NF-κBp65活性升高，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，West

12、em blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組的NF-κBp65表達(dá)量比較高(P＜0.05)，加藥組(4μg/ml、10μg/ml、25μg/ml)的NF-κBp65蛋白的表達(dá)量均低于模型組(P＜0.05)，加藥組隨著濃度的增加蛋白表達(dá)逐漸下降。
　　[結(jié)論]：
　　1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-L-葡萄糖苷可以明顯抗氧化損傷和減少細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。即抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidativestress)和