三種雙生病毒及其伴隨衛(wèi)星DNA的致病性研究.pdf

1、雙生病毒是一類世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的植物單鏈DNA病毒，已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的作物上造成毀滅性災(zāi)害。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，很多單組份雙生病毒伴隨有誘導(dǎo)典型癥狀所必需的衛(wèi)星DNAβ分子。這類衛(wèi)星DNAβ分子與其輔助病毒形成了一種新型的病害復(fù)合體，給亞洲和非洲地區(qū)的農(nóng)作物生產(chǎn)造成了巨大損失。為了更好的了解雙生病毒的致病機(jī)理，本論文圍繞三種雙生病毒及其衛(wèi)星DNAβ的致病性進(jìn)行了研究： l.與賽葵黃脈病毒相伴隨的衛(wèi)星DNAβ的分子變異及致病性研

2、究目前對(duì)雙生病毒伴隨的衛(wèi)星DNAβ的變異研究主要集中在來(lái)自不同寄主的衛(wèi)星DNAβ之間，本論文則對(duì)來(lái)自我國(guó)云南省不同地區(qū)賽葵上的20個(gè)與賽葵黃脈病毒(MYVV)相伴隨的衛(wèi)星DNAβ進(jìn)行了克隆、測(cè)序和遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)這些衛(wèi)星DNAβ之間雖然變異較小，但是仍然具有按地理分布聚類的特征。侵染性測(cè)定表明衛(wèi)星DNAβ對(duì)于MYVV在本氏煙、心葉煙、矮牽牛和賽葵上引起典型的病害癥狀是必需的。進(jìn)一步將MYVV與泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒(TYLCTHV)DN

3、Aβ或中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)DNAβ共同接種本氏煙，發(fā)現(xiàn)MYVV可以支持異源雙生病毒的衛(wèi)星DNAβ在本氏煙中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄復(fù)制和系統(tǒng)移動(dòng)，且病毒DNA在組織中的積累量與產(chǎn)生癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。 2.中國(guó)番茄曲葉病毒及其衛(wèi)星DNAβ的分子鑒定和致病性研究利用菜豆金色花葉病毒屬病毒的簡(jiǎn)并引物，對(duì)從廣西省采集的表現(xiàn)出葉片下卷等癥狀的番茄樣品(G16、G17和G18)進(jìn)行了PCR檢測(cè)，經(jīng)過(guò)克隆、測(cè)序發(fā)現(xiàn)這些樣品均感染了雙生

4、病毒。對(duì)所得到的部分病毒基因組序列進(jìn)行聯(lián)配比較后發(fā)現(xiàn)它們具有96.6％到98.5％的序列同源性，表明它們感染了同一個(gè)雙生病毒。因此對(duì)其中的G16和G18分離物進(jìn)行了病毒全基因組序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)G16和G18的全長(zhǎng)分別為2729個(gè)核苷酸(AJ704602)和2733個(gè)核苷酸(AJ558119)，它們之間的序列同源性達(dá)到987％。與其它已報(bào)道的雙生病毒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，G16和G18與越南番茄曲葉病毒的相似性最高，分別為83.6％和82.8％。根

5、據(jù)雙生病毒“種”的分類標(biāo)準(zhǔn)，G16和G18代表同一個(gè)雙生病毒新種的不同分離物，因此我們將這個(gè)雙生病毒新種命名為中國(guó)番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV)。系統(tǒng)進(jìn)化及重組分析發(fā)現(xiàn)ToLCCNV可能是一個(gè)由重組產(chǎn)生的新病毒。進(jìn)一步通過(guò)PCR的方法發(fā)現(xiàn)這些分離物中都含有衛(wèi)星DNAβ，并對(duì)其全序列也進(jìn)行了測(cè)定。序列測(cè)定表明與G16、G17和G18三個(gè)分離物伴隨的DNAβ的全長(zhǎng)分別為1346個(gè)核苷

6、酸、1341個(gè)核苷酸和1342個(gè)核苷酸(AJ704610-AJ704612)。與其它已報(bào)道的衛(wèi)星DNAβ的序列比較發(fā)現(xiàn)這三個(gè)DNAβ分子都與中國(guó)番茄黃化曲葉病毒Y8分離物的DNAβ具有最高的同源性，分別達(dá)到49.1％、49.1％和49.8％。同時(shí)，為了研究衛(wèi)星DNAβ的致病性及生物學(xué)功能，構(gòu)建了ToLCCNV-G18及其伴隨的衛(wèi)星DNAD的侵染性克隆，致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星DNAβ是ToLCCNV誘導(dǎo)產(chǎn)生典型的病害癥狀所必需的，同時(shí)其還能提

7、高ToLCCNV在寄主植物中的積累量。 利用農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)等方法發(fā)現(xiàn)ToLCCNV DNAβ編碼的βC1蛋白為RNA沉默抑制子。同時(shí)為了明確βC1蛋白中維持RNA沉默抑制子功能的關(guān)鍵氨基酸基序，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果構(gòu)建了7個(gè)不同區(qū)段缺失的βC1突變體。農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)試驗(yàn)、Northern及Western印跡雜交結(jié)果表明βC1蛋白的44-74位氨基酸構(gòu)成的中心結(jié)構(gòu)域(central domain)對(duì)于維持βC1抑制子活性是至關(guān)重要

8、的。 由于目前已報(bào)道的大多數(shù)RNA沉默抑制子也是致病因子，所以又構(gòu)建了7個(gè)βC1不同區(qū)段缺失的DNAβ的突變體的侵染性克隆。侵染性測(cè)定發(fā)現(xiàn)所有的突變體都可以在ToLCCNV的輔助下系統(tǒng)侵染本氏煙，但是均不能誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的癥狀，表明βC1蛋白的任何一段氨基酸序列都是其誘導(dǎo)產(chǎn)生典型病害癥狀所必需的。Southern印跡雜交分析發(fā)現(xiàn)雖然所有的突變體都能夠在本氏煙中復(fù)制并且各個(gè)突變體之間的復(fù)制水平以及對(duì)輔助病毒的影響不盡相同，但是總體來(lái)

9、說(shuō)它們的復(fù)制水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型DNAβ的復(fù)制水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性并不是其誘導(dǎo)產(chǎn)生病害癥狀的決定因素。 為了確定βC1蛋白及其突變體的亞細(xì)胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)βC1及其突變體與GFP的融合蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不具備RNA沉默抑制子活性的突變體βC1 dm44-60和βC1 dm61-74也不能在細(xì)胞核中定位，而野生型及其它突變體βC1則均能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)

10、中定位，表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性與其能否在細(xì)胞核中定位有關(guān)，其44-74位氨基酸構(gòu)成的中心結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性和在細(xì)胞核中的定位都是必需的。從ToLCCNV單獨(dú)接種或與其衛(wèi)星DNAβ共同接種的本氏煙中克隆到了11個(gè)病毒或衛(wèi)星DNAβ來(lái)源的小RNA。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)這些來(lái)源于病毒的小RNA主要集中在CP的轉(zhuǎn)錄區(qū)和βC1的轉(zhuǎn)錄區(qū)，表明病毒可能具有產(chǎn)生小RNA的熱點(diǎn)區(qū)。 3.泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒是

11、一個(gè)伴隨有衛(wèi)星DNAβ的單組份雙生病毒泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒(TYLCTHV)引起的番茄黃化曲葉病是影響泰國(guó)番茄生產(chǎn)最重要的病害之一，為了明確該病毒到底是單組份雙生病毒還是雙組份雙生病毒，構(gòu)建了TYLCTHV-Y72分離物及其伴隨的衛(wèi)星DNAβ的侵染性克隆。致病性測(cè)定表明TYLCTHV可以單獨(dú)侵染本氏煙、心葉煙和番茄并誘導(dǎo)產(chǎn)生典型的癥狀，但是當(dāng)與其衛(wèi)星DNAβ共同接種時(shí)則能夠加重病害癥狀，并且可以提高病毒在植物組織中的積累量。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)

12、結(jié)果以及之前的相關(guān)報(bào)道，我們認(rèn)為T(mén)YLCTHV是一個(gè)伴隨有衛(wèi)星DNAβ的單組份雙生病毒。 4.廣西番茄曲葉病是由兩種雙生病毒及衛(wèi)星DNA復(fù)合侵染引起的通過(guò)PCR、Southern印跡、RCA-PCR以及測(cè)序等方法對(duì)采自廣西省表現(xiàn)出曲葉癥狀的31個(gè)番茄樣品進(jìn)行了復(fù)合侵染檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雙生病毒的復(fù)合侵染是導(dǎo)致廣西省番茄曲葉病的重要原因。所有檢測(cè)的樣品中均含有ToLCCNV和中國(guó)番木瓜曲葉病毒(PaLCCNV)兩種病毒，同時(shí)還伴隨有ToL