MicroRNA-10b靶向CDH1促進乳腺癌轉移的初步研究.pdf

1、第一部分：目的：研究乳腺癌組織及正常乳腺組織中miR-10b、CDH1mRNA以及上皮鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的表達及其臨床意義，分析miR-10b與CDH1mRNA以及E-cad之間的相互關系。
　　 方法：采用實時熒光定量RT-PCR(FQ-RT-PCR)方法分別檢測16例正常乳腺組織、21例原發(fā)性乳腺癌組織及23例轉移性乳腺癌組織中miR-10b 及CDH1mRNA的表達水平；使用Western blo

2、t 方法檢測三種組織中E-cad 蛋白的表達水平。
　　 結果：1.原發(fā)性乳腺癌組織與正常乳腺組織相比，miR-10b基因表達輕度下降約18.8％（p=0.132）；轉移性乳腺癌組織與正常乳腺組織及原發(fā)性乳腺癌組織相比miR-10b基因表達明顯升高分別達5.0 倍及6.1 倍（p=0.015）。2.原發(fā)性乳腺癌組織與正常乳腺組織相比，CDH1mRNA表達輕度升高約11.5％（p=0.270）；轉移性乳腺癌組織與正常乳腺組織及原發(fā)

3、性乳腺癌組織相比CDH1mRNA表達顯著下降分別達4.6 倍及5.1 倍（p=0.021）。3.原發(fā)性乳腺癌組織與正常乳腺組織相比，E-cad表達輕度升高約20％（p=0.386）；轉移性乳腺癌組織與正常乳腺組織及原發(fā)性乳腺癌組織相比E-cad表達顯著下調分別達5.2 倍及6.3 倍（p=0.007）。4.miR-10b的表達水平與乳腺癌組織的腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、人表皮生長因子受體2（Humanepidermal grow

4、th factor receptor-2，Her-2）狀態(tài)、增殖細胞核抗原Ki-67 數(shù)值及臨床分期呈正相關性，與雌激素受體（Estrogen receptor，ER）及孕激素受體（Progesteronereceptor，PR）狀態(tài)呈負相關性（p＜0.05），而與腫瘤組織學類型及患者年齡無關（p>0.05）。5.乳腺癌中miR-10b表達與CDH1mRNA和E-cadherin 蛋白表達之間存在相關性。
　　 結論：1.miR

5、-10b在轉移性乳腺癌中的表達水平顯著升高，CDH1mRNA 及E-cad表達水平顯著降低，miR-10b與CDH1mRNA 及E-cad 之間存在顯著負相關。2.miR-10b可能通過靶向調控CDH1mRNA的表達發(fā)揮促進乳腺癌轉移的作用。3.miR-10b與乳腺癌的臨床不良預后因素存在密切聯(lián)系，miR-10b 可以作為乳腺癌轉移及預后判斷的預測因子。
　　 第二部分：目的：分析下調miR-10b后CDH1mRNA與E-cad

6、表達水平的變化以及對MDA-MB-231人乳腺癌細胞侵襲能力的影響，探討miR-10b在乳腺癌轉移中的作用及其通路。
　　 方法：通過脂質體介導miR-10b 抑制劑(inhibitor)瞬時轉染MDA-MB-231人乳腺癌細胞,在熒光顯微鏡下觀察瞬時轉染情況。轉染后48 小時，采用實時熒光定量RT-PCR（FQ-RT-PCR）方法檢測MDA-MB-231人乳腺癌細胞中miR-10b 及CDH1mRNA基因的表達，Western

7、 blot 技術用于檢測MDA-MB-231人乳腺癌細胞中上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達情況。設轉染試劑組（Mock組）為對照。采用transwell細胞侵襲實驗評價轉染miR-10b inhibitor后MDA-MB-231細胞侵襲能力的變化。
　　 結果：1.脂質體轉染4-6 小時后即可觀察到羥基熒光素基團發(fā)出的綠色熒光。2.轉染inhibitor MDA-MB-231人乳腺癌細胞中miR-10b的表

8、達顯著降低（p=0.010），CDH1mRNA的表達明顯增加（p=0.009），E-cad 蛋白相對表達量顯著升高（p=0.037）。3.miR-10b表達降低后轉染miR-10b inhibitor組透膜細胞數(shù)目顯著下降（p=0.033）。
　　 結論：1.下調miR-10b 可使CDH1mRNA 及E-cad 蛋白表達明顯升高，并顯著降低MDA-MB-231人乳腺癌細胞的侵襲能力。2.本細胞功能研究初步驗證了乳腺癌中存在mi

9、R-10b/CDH1mRNA 促轉移通路。
　　 第三部分：目的：分析過表達miR-10b后CDH1mRNA與E-cad表達水平的變化以及對MDA-MB-231人乳腺癌細胞侵襲能力的影響，探討miR-10b在乳腺癌轉移中的作用及其通路。
　　 方法：通過脂質體介導體內成熟的miR-10b模擬物 (mimics)瞬時轉染MDA-MB-231人乳腺癌細胞,在熒光顯微鏡下觀察瞬時轉染情況。轉染后24 及48 小時，采用實時熒光

10、定量RT-PCR（FQ-RT-PCR）方法檢測MDA-MB-231人乳腺癌細胞中miR-10b 及CDH1mRNA基因的表達，Western blot 技術用于檢測MDA-MB-231人乳腺癌細胞中上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達情況。設轉染試劑組（Mock組）為對照。采用transwell細胞侵襲實驗評價轉染miR-10b mimics后MDA-MB-231細胞侵襲能力的變化。
　　 結果：1.脂質體轉染

11、4-6 小時后即可觀察到羥基熒光素基團發(fā)出的綠色熒光。2.
　　 轉染mimics MDA-MB-231人乳腺癌細胞中miR-10b的表達顯著升高（p=0.001），CDH1mRNA的表達顯著下降（p=0.002），E-cad表達量較對照組下降12.5倍（p=0.006）。3.miR-10b表達升高后轉染miR-10b mimics組透膜細胞數(shù)目顯著增加（p=0.018）。
　　 結論：1.過表達miR-10b 可使CD