14-3-3γ通過mTOR信號通路調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成機(jī)理.pdf

1、14-3-3γ通過mTOR途徑調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成乳品質(zhì)是乳品工業(yè)的重要基礎(chǔ)，而乳蛋白含量是乳品質(zhì)的代表性指標(biāo)。近年來，隨著乳品工業(yè)的發(fā)展和健康消費的需求，人們對乳制品的需求越來越多。但在中國和很多發(fā)展中國家，生乳品質(zhì)低下已成為制約奶牛飼養(yǎng)行業(yè)的關(guān)鍵因素。研究人員開始聚焦如何提高乳品質(zhì)和產(chǎn)量，而通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法闡明乳蛋白和乳脂肪合成的調(diào)控機(jī)理已成為這一領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容。國內(nèi)外研究已取得了一定的進(jìn)展，已證實PI3K/AKT/

2、mTOR是調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的主要信號通路，而在奶牛乳腺上皮細(xì)胞營養(yǎng)素和激素能夠通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)乳的合成。
　　14-3-3蛋白家族成員廣泛存在于各類生物組織細(xì)胞中，參與很多生物學(xué)過程，如細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、增殖、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等。14-3-3蛋白通過決定底物的亞細(xì)胞定位以促進(jìn)和抑制有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)如mTOR信號通路過程。盡管已有很多這方面的報道，但還不清楚14-3-3是否通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)乳合成

3、和細(xì)胞增殖。本實驗室前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作發(fā)現(xiàn)，14-3-3γ與乳蛋白合成相關(guān)，但其作用機(jī)制尚不清楚。因此本文通過基因功能研究以闡明14-3-3γ是否通過調(diào)節(jié)乳合成和細(xì)胞增殖。
　　首先采用組織塊法培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞角蛋白18和β-酪蛋白的表達(dá)以確定細(xì)胞純化成功并具有泌乳的能力。激光共聚焦顯微鏡觀察表明14-3-3γ定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。Western blotting分析表明，蛋氨酸、賴氨酸、

4、雌激素和催乳素均能刺激14-3-3γ表達(dá)，HPLC檢測發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白的分泌也顯著增加，甘油三酯試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)乳脂肪的分泌也顯著增加，CASY細(xì)胞活力分析儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)也顯著增加。這些結(jié)果提示14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和增殖過程中起著正向調(diào)節(jié)作用。
　　構(gòu)建pGCMV-IRES-EGFP-14-3-3γ表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，繼而利用G418篩選構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染14-3-3γ的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞系

5、，以此為材料研究14-3-3γ對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ過表達(dá)后，mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)顯著增加，細(xì)胞分泌酪蛋白和甘油三酯顯著增多。
　　另一方面，將14-3-3γ的siRNA利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，觀察其對泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ基因沉寂后，mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)顯著下降，細(xì)胞分泌酪蛋白和