載脂蛋白E4神經(jīng)毒作用及其可能的NMDA受體機(jī)制：電生理和胞內(nèi)鈣成像研究.pdf

1、山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文載脂蛋白E4神經(jīng)毒作用及其可能的NMDA受體機(jī)制：電生理和胞內(nèi)鈣成像研究姓名：李新毅申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生理學(xué)指導(dǎo)教師：祁金順20080517山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中，N M D A 受體由于其對鈣離子的高通透性使其在參與突觸可塑性如L T P 的形成中具有重要意義：但同時N M D A 受體過度激活形成的鈣超載也是誘發(fā)神經(jīng)毒性作用的重要環(huán)節(jié)。分子生物學(xué)及配體結(jié)合同位素顯像技術(shù)已經(jīng)證明，A D 病人中N M

2、 D A 受體表達(dá)水平明顯下降，然而相反的現(xiàn)象是N M D A 受體功能在A D 發(fā)病過程中卻病理性地被過度激活了。N M D A 受體功能過度激活的原因尚不清楚，載脂蛋白E 是否在N M D A 受體的過度激活中發(fā)揮重要作用? 采用分離或培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞觀察載脂蛋白E 對N M D A 受體介導(dǎo)的電流是否具有直接影響可能是解決這一問題的一個重要手段。作為N M D A 受體過度激活的結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增高成為一個重要的引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)的事件，同時也是一個可供檢測N M D A 受體功能活動的指標(biāo)。一系列證據(jù)表明胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂是A D 發(fā)病過程中的最早的分子事件之一，支持了最早由K h a c h a t u r i a n 提出的假說，即胞內(nèi)鈣信號的持續(xù)性失調(diào)對于A D 的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。與A D 發(fā)病密切相關(guān)的載脂蛋白E 4 是否能夠經(jīng)由N M D A 受體途徑引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)增高從而影響神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)，有望通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光成像技術(shù)進(jìn)一步澄清。鑒

4、于以上分析，本研究的主要目的在于：( 1 ) 利用場電位記錄技術(shù)探討不同亞型的載脂蛋白E ( a p o E 4 和a p o E 3 ) 對大鼠在體海馬L T P 的調(diào)制作用，并闡明其可能的作用途徑； ( 2 )利用膜片鉗技術(shù)觀察不同亞型的載脂蛋白E 對N M D A 受體介導(dǎo)的全細(xì)胞電流的直接效應(yīng)，以證實(shí)N M D A 受體是否是載脂蛋白E 發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的～個重要靶點(diǎn)； ( 3 ) 采用細(xì)胞內(nèi)鈣成像技術(shù)證實(shí)載脂蛋白E 是否影響細(xì)

5、胞的鈣穩(wěn)態(tài)及其可能的N M D A 受體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究將為探討載脂蛋白E 參與A D 發(fā)病的分予機(jī)制，進(jìn)而制定相應(yīng)的防治策略以阻止疾病進(jìn)程、改善臨床結(jié)局提供有益的線索。為此，實(shí)驗(yàn)分以下三部分進(jìn)行。第一部分：載脂蛋白E 對大鼠海馬C A l 區(qū)在體L T P 的影響本實(shí)驗(yàn)通過急性側(cè)腦室內(nèi)注射重組人a p o E 4 和a p o E 3 并記錄海馬場興奮性突觸后電位( f i e l de x c i t a t o 眄p o s t

6、s y n a p t i c p o t e n t i a l ，f E P S P ) ，觀察了不同亞型載脂蛋白E 對大鼠海馬C A l區(qū)在體L T P 的作用及其可能的N M D A 受體機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用W i s t a r 大鼠，麻醉后將其固定在腦立體定位儀上，分別將腦室套管和捆綁的同心圓雙極刺激電極和單極記錄電極，精確插入到側(cè)腦室或海馬刺激與記錄部位。通過給予海馬s c h a f ．f e r 側(cè)枝單個電刺激、強(qiáng)直電刺激和

7、雙脈沖刺激，在海馬C A l 區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)的f E P S P 、強(qiáng)直刺激引起的f E P S P 的長時程增強(qiáng)即L T P 、以及配對脈沖引起的雙脈沖易化( p a i r e d p u l s ef a c i l i t a t i o n ，P P F ) 。經(jīng)腦窒套管向側(cè)腦室內(nèi)注射重組人a p o E 4 或a p o E 3 ，或／和腹腔內(nèi)注射N M D A 受體非競爭性拮抗劑M K 8 0 1 ，觀察各種藥物對