餐后富含甘油三酯脂蛋白中的載脂蛋白E在成脂分化中的作用.pdf

1、背景：
　　近年來，肥胖的發(fā)病率逐漸升高。作為糖尿病、冠心病、中風(fēng)、癌癥等多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，肥胖已成為日趨嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。肥胖是白色脂肪細(xì)胞肥大、增生和白色脂肪組織增多的結(jié)果。高甘油三酯血癥患者血中增多的富含甘油三酯脂蛋白(TRLs)與肥胖密切相關(guān)。TRLs不僅參與脂肪細(xì)胞肥大，而且促進(jìn)脂肪細(xì)胞增生。極低密度脂蛋白（VLDL）及殘粒脂蛋白可誘導(dǎo)各種前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，且VLDL誘導(dǎo)的成脂分化依賴于脂蛋白表面的

2、載脂蛋白E(ApoE)，但潛在的機(jī)制尚不清楚。ApoE可與多種脂蛋白受體結(jié)合，作為配體參與細(xì)胞受體介導(dǎo)的脂蛋白內(nèi)吞過程。在肝細(xì)胞中，低密度脂蛋白受體(LDLR)家族成員及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)均可識(shí)別脂蛋白中的ApoE，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)TRLs的攝取及降解。成脂分化中脂肪細(xì)胞表面也表達(dá)這些受體。故推測:TRLs中的ApoE在成脂分化中的重要作用可能涉及到ApoE依賴性的脂蛋白內(nèi)吞作用。
　　目的：
　　(1)觀察TRLs

3、中的ApoE對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞成脂分化的影響;
　　(2)探討成脂分化中的脂肪細(xì)胞是否依賴于ApoE內(nèi)吞TRLs;
　　(3)明確分化中的脂肪細(xì)胞內(nèi)吞TRLs顆粒的受體途徑。
　　方法：
　　收集人與小鼠高脂餐后4小時(shí)的血漿，利用密度梯度分離法獲得富含甘油三酯的脂蛋白(TRLs)，將獲得的TRLs干預(yù)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
　　(1)在有或無胰島素（10ug/mL）的輔助下，分

4、別以不同質(zhì)量濃度的人TRLs(h-TRL s)(25、50、100、150mg/L)孵育細(xì)胞14天，以及用100mg/L h-TRLs與10ug/mL胰島素孵育細(xì)胞0、4、7、10、14天，通過油紅O染色檢測脂滴，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot檢測脂肪細(xì)胞標(biāo)志物—脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、核調(diào)控因子—過氧化物酶體增殖活化受體γ(PPAR-γ)及CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白(CEBPs)的表達(dá)，旨在觀察人TRLs的促成脂分化作用;

5、
　　(2)在胰島素(10ug/mL)的輔助下，分別用100mg/L的野生型小鼠的餐后TRLs或ApoE基因敲除小鼠的餐后TRLs孵育細(xì)胞14天，通過油紅O染色檢測脂滴，觀察餐后TRLs表面的ApoE在成脂分化中的作用;
　　(3)用能發(fā)出紅色熒光的Atto565 NHS標(biāo)記各種TRLs，通過激光共聚焦顯微鏡觀察餐后TRLs被分化中的脂肪細(xì)胞內(nèi)吞的情況，以明確TRLs中的ApoE在細(xì)胞內(nèi)吞TRLs中的作用;
　　(4)

6、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot檢測成脂分化過程中ApoE相關(guān)脂蛋白內(nèi)吞受體的表達(dá);
　　(5)利用受體相關(guān)蛋白（RAP）或肝素分別干擾TRLs與LDLR家族成員或HSPG的結(jié)合，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)吞TRLs的情況，以探討分化中的脂肪細(xì)胞內(nèi)吞餐后TRLs的受體途徑。
　　結(jié)果：
　　1、人的餐后TRLs在胰島素（10ug/mL）的輔助作用下可成功誘導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞:在

7、胰島素的輔助下，細(xì)胞內(nèi)的脂滴含量與TRLs質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(r=0.971，P＜0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR提示aP2及PPAR-γ的mRNA水平隨TRLs質(zhì)量濃度的增加而表達(dá)上調(diào)(P＜0.05）;Western Blot發(fā)現(xiàn):aP2或PPAR-γ的蛋白含量不僅與TRLs質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(aP2:r1=0.993，P1＜0.01; PPAR-γ:r1=0.900，P1＜0.05);而且與100mg/L TRLs處理時(shí)間呈正相關(guān)(aP2

8、:r2=0.964,P2＜0.01; PPAR-γ:r2=0.975,P2＜0.01)。
　　2、在胰島素（10ug/mL）的輔助下，野生型小鼠TRLs處理組細(xì)胞內(nèi)有明顯的脂滴，ApoE基因敲除小鼠TRLs處理組細(xì)胞內(nèi)脂滴形成明顯減少。
　　3、激光共聚焦顯微鏡證實(shí):人和野生型小鼠TRLs處理組細(xì)胞內(nèi)均可見明顯的紅色熒光標(biāo)記的TRLs顆粒，ApoE基因敲除小鼠TRLs處理組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光標(biāo)記的TRLs顆粒顯著減少。
　

9、　4、在人TRLs誘導(dǎo)的成脂分化中:
　　(1)不同濃度TRLs處理組低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP1)基因水平低于胰島素對(duì)照組，但LRP1蛋白水平隨TRLs質(zhì)量濃度增大有增多的趨勢(shì)。
　　(2)與未分化的3T3-L1細(xì)胞相比，在100mg/L TRLs處理組的各個(gè)階段，LRP1蛋白水平無明顯變化，但持續(xù)存在較高的表達(dá)水平。
　　5、與對(duì)照組相比，肝素處理組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光標(biāo)記的TRLs顆粒無明顯變化，RAP處理組細(xì)胞