黃芪甲苷抑制載脂蛋白E基因缺陷小鼠心臟重構的機制研究.pdf

1、心臟重構是指心臟受到各種內外刺激后，心臟形態(tài)、結構和功能等出現一系列適應性改變，其病理特點主要包括心肌肥厚及間質纖維化等，其病理機制主要涉及神經內分泌系統(tǒng)的激活。心臟重構早期為代償性適應，晚期失代償可發(fā)展為慢性心衰(congestive heart failure，CHF)，而CHF是全球人群病死率的一個主要原因。因此，在臨床中，抑制心臟重構是治療CHF的重要策略，如β受體阻滯劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)拮抗劑等抑制神經內分泌系統(tǒng)藥

2、物的使用，對預防心臟重構、治療CHF均取得一定效果。但CHF的發(fā)病率和病死率仍居高不下，因此研究心臟重構分子機制及干預藥物具有必要性。
　　高膽固醇血癥被認為是心血管疾病，尤其是冠心病的主要危險因素之一，它可增加全因死亡率，其負面臨床意義已得到反復證實。既往研究提示高膽固醇血癥是引起左心室肥厚的獨立危險因素，在心臟重構的發(fā)病及進展中起重要作用。載脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠是被廣泛用作研究高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化性等疾

3、病的動物模型，ApoE-/-除有血管表型外，還有如心臟質量增加、室壁厚度增加、心肌纖維化和心功能減低等心臟表型改變。關于ApoE-/-小鼠心臟重構的機制以及相關干預措施的研究很少。同時，高膽固醇血癥對心肌細胞的再生、老化、凋亡以及P53信號轉導通路的影響也知之甚少。
　　黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，ASTⅣ)是從中藥黃芪中分離出來的一種羊毛脂醇型四環(huán)三萜天然單體皂苷，具多重抗心血管疾病藥理活性，既往研究證實ASTⅣ可以

4、抑制病毒感染、缺血缺氧等引起的心臟重構，降低心肌細胞凋亡率，減輕心肌纖維化，抗氧化應激等。然而，ASTⅣ對高膽固醇血癥引起的心臟重構的影響及可能機制的研究尚無。因此，本研究目的是觀察ASTⅣ干預ApoE-/-小鼠心臟重構的療效及探索其相關機制。
　　目的：
　　驗證假說:高膽固醇血癥可引起心肌細胞增殖能力改變，促進心肌細胞老化、凋亡和心肌纖維化，影響P53信號轉導通路的激活狀態(tài)，最終導致以心肌肥厚、心功能下降為特點的病理性心

5、臟重構;而ASTⅣ治療能抑制高膽固醇血癥所致的心臟重構，進而改善心功能。
　　方法：
　　1.AST-Ⅳ準備
　　ASTⅣ的純度≥98％，羥丙基-β-環(huán)糊精溶解為濃度1％和10％ ASTⅣ溶液。
　　2.動物分組
　　雄性ApoE-/-小鼠隨機分為高脂模型組(KO，n=14)，低濃度ASTⅣ干預組(AST-LD，n=7)，高濃度ASTⅣ干預組(AST-HD，n=8)，以同齡同性別野生型C57BL/6J小鼠(

6、WT，n=15)為對照組。8周齡時，分別獲取WT(n=8)和KO(n=7)組小鼠治療前各參數的基線水平。此后，AST-LD和AST-HD組分別隔日腹腔注射1mg/kg和10 mg/kg的ASTⅣ，余組以同方式同時長給予等劑量溶劑，SPF級普食喂養(yǎng)。藥物干預8周（即小鼠16周齡），心臟超聲檢查后處死小鼠，取血及心臟標本，保存待檢。
　　3.心臟超聲、血脂和心臟質量檢測
　　小鼠麻醉后，超聲檢測左室內徑及后壁厚度，計算左室射血分

7、數和縮短分數。禁食不禁飲12小時，稱重后取血處死，分離血漿以測血脂四項;取心臟標本，測量心臟質量和左心室質量，隨后垂直于心臟縱軸將左心室分為兩部分，一部分用置于包埋劑用作冰凍切片，另一分部保存于超低溫冰箱后期備用。
　　4.心肌纖維化，免疫熒光染色法，心肌細胞尺寸和數量的檢測
　　馬松染色檢測心肌纖維化。免疫熒光染色檢測各目標蛋白在心臟組織中的表達。使用心肌肌鈣蛋白Ⅰ單抗標記心肌細胞;檢測目標蛋白如與心臟的氧化應激相關蛋白尼

8、克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)，抗氧化應激相關蛋白超氧化物歧化酶1、2(SOD1、2)，細胞增殖相關蛋白Ki67，細胞老化相關蛋白P16INK4a。參考文獻方法測量心肌細胞尺寸和數量。
　　5.末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)檢測細胞凋亡
　　細胞死亡原位檢測試劑盒（熒光標記法）用于檢測心肌細胞的凋亡。
　　6.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(QRT-PCR)檢測心臟基因轉錄

9、表達情況
　　從心臟組織提取總RNA，逆轉錄成cDNA，QRT-PCR法檢測與細胞生長周期、增殖、老化、P53信號轉導通路、氧化應激等相關基因mRNA的表達。
　　結果：
　　1.血脂四項:ApoE-/-小鼠在8周齡時已進展為高膽固醇血癥(TC和LDL-C較WT組分別上升3.7倍和8.7倍，甘油三酯(TG)不增高，HDL-C濃度較WT組下降23％）。16周齡時，ApoE-/-小鼠血脂變化趨勢類似。ASTⅣ治療ApoE-

10、/-小鼠8周后，血漿TC和LDL-C濃度較KO組上升，提示本實驗中未觀察到ASTⅣ有降血漿膽固醇作用。
　　2.心臟質量和尺寸:ApoE-/-小鼠8周齡時心臟較WT組已表現為心肌肥厚，其心臟質量(HW，1.1倍)、左心室質量（LVW，1.3倍）、心臟質量體重比(HW/BW，1.1倍)、左心室質量體重比（LVW/BW，1.3倍）以及左心室質量心臟質量比（LVW/HW，1.2倍）均顯著增加，左心室長軸(LAX)也增加1.1倍。16周時

11、這些參數的差異仍然維持，ASTⅣ治療8周后，這些參數在AST-HD組較KO組分別下降了HW24％、LVW28％、HW/BW8％、LVW/BW10％、LVW/HW5％、LAX10％; AST-LD組沒有顯著改變。
　　3.心臟超聲檢測結果:與上述心臟質量和尺寸的變化趨勢一致。8周齡時ApoE-/-小鼠較WT組左室舒張末期內徑(LVDd)增加14％，左室收縮末期內徑(LVDs)增加11％，左室舒張末期容積(LVEDV)和左室收縮末期容

12、積(LVESV)分別增加39％和30％。16周時，除LVDs外，ApoE-/-小鼠LVESV較WT組增加至35％，左室射血分數(LVEF)、縮短分數(FS)、舒張期末左室后壁厚度(LVPWd)、收縮期末左室后壁厚度(LVPWs)分別下降11％、13％、13％、6％。提示高膽固醇血癥小鼠心臟室壁厚度變薄和收縮功能受損變化。經AST V治療后，AST-HD組小鼠LAX減小，LVESV恢復，EF由54％上升至60％，FS由28％上升至31％。

13、AST-LD組較KO組在心臟超聲方面并沒有顯著差異。
　　4.心臟纖維化:8周齡ApoE-/-小鼠較WT組左心室膠原蛋白含量沒有差異，但16周時膠原蛋白分數是WT組2倍，高劑量ASTⅣ治療后，膠原蛋白分數減低至KO組一半。提示高膽固醇血癥易致心臟纖維化，ASTⅣ具有明顯抑制心臟纖維化作用。
　　5.心肌細胞體積和數量:8周齡ApoE-/-小鼠較WT組心肌細胞體積增加19％，心肌細胞數量無改變;16周，心肌細胞體積增加了38％

14、，心肌細胞數量減少了14％。而AST-LD和AST-HD組小鼠的心肌細胞體積較KO組的分別減低了19％和27％，AST-HD組小鼠的心肌細胞數量較KO組相比增加了10％。
　　6.增殖、老化蛋白的表達:8周齡ApoE-/-小鼠較WT組ki67陽性心肌細胞數占心肌細胞總數比例基本相等，16周時該比例減至WT組的80％，而高劑量ASTⅣ治療后該比例較KO組增加3倍，ki67陽性細胞占整個心臟細胞總數比例增加2倍。其次，8周齡ApoE-

15、/-小鼠較WT組在P16INK4a陽性心肌細胞數占心肌細胞總數比例無差異，16周時，該比例增為WT組的2.9倍，而低劑量和高劑量ASTⅣ治療后該比例較KO組分別減低了39％和60％。ki67陽性細胞占整個心臟細胞總數比例顯著減低55％。
　　7.心臟細胞凋亡:8周齡ApoE-/-小鼠心肌細胞凋亡(＜2％)與WT組無差異。16周齡ApoE-/-小鼠凋亡心肌細胞數占總心肌細胞數比例超過WT組的23倍。AST-LD和AST-HD組的心肌

16、細胞凋亡較KO組分別減少了87％和90％。凋亡陽性細胞占心臟細胞總數比例呈類似變化規(guī)律。
　　8.氧化應激和抗氧化應激:8周時ApoE-/-小鼠較WT組心臟NOX4陽性細胞占心臟細胞總數比例、SOD1和SOD2的陽性表達面積均無顯著改變;16周時，ApoE-/-小鼠NOX4陽性細胞占心臟總細胞比例是WT組的1.3倍，同時SOD2的陽性表達面積顯著減小，SOD1相對表達面積沒有顯著差異。AST-LD和AST-HD組的NOX4陽性細胞

17、占心臟總細胞比例較KO組分別降低16％和17％，SOD1和SOD2的表達則均無顯著改變。
　　9.目的基因轉錄:本實驗檢測了細胞周期、增殖、老化和P53信號轉導通路和氧化應激相關基因表達的情況。
　　1)8周時，ApoE-/-小鼠較WT組Cyclin D1（2.2倍）和MCM5(2.7倍)上調，CDKN1A(70％)和CDKN1B(28％)下調，其余細胞周期相關基因在轉錄水平均無顯著改變。16周時，ApoE-/-小鼠較WT組

18、反映細胞生長停滯的基因CDKN1A（7倍）、CDKN1B（2.7倍）、CDKN2A（9.6倍）明顯上調，其中CDKN2A上調與前述翻譯產物P16INK4a蛋白質表達變化一致，而CDK4（2.2倍），Cyclin B1（11.3倍），Ki67(4.7倍)和MCM5(3.6倍)顯著上調，其中Ki67mRNA表達與前述蛋白表達不完全一致。ASTⅣ治療后CDKN1A，CDKN1B，CDKN2A，MCM5，Cyclin B1、D1、E1、A2和C

19、DK4在AST-LD和AST-HD兩組均顯著下調。
　　2)8周時，ApoE-/-小鼠心臟除P53上調（1.6倍）和Mcl1下調(27％)之外，其余檢測的P53信號轉導通路相關基因(TP53、Bax、Bcl2、caspase-3、Mdm2、ATM、GADD45A)較WT組沒有顯著差異;16周時除Bax和GADD45A外，其余檢測基因表達上調了2.5倍以上。ASTⅣ治療后上述基因表達顯著下調。
　　3)8周時，ApoE-/-小

20、鼠心臟與氧化應激相關基因(Duox1、Srxn1、NOX1、NOX4、GPX2、SOD1)表達較WT組無顯著改變;16周時，除Duox1和SOD1外，余檢測基因均出現了不同程度的上調，ASTⅣ治療后較KO組顯著下調。
　　結論：
　　本研究中觀察到ApoE-/-小鼠心肌細胞增殖能力減低，細胞老化、凋亡加重，心肌纖維化和心臟中P53信號轉導通路相關基因表達增高，這些與高膽固醇血癥小鼠發(fā)生心肌肥厚、心臟收縮功能下降等病理性心臟重