BLG-hLF基因轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞及TSA對轉(zhuǎn)染基因表達的影響.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器是當前生物工程研究的熱點。當人們將外源基因轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞以后，總是希望外源基因能高效表達，并通過轉(zhuǎn)基因動物克隆技術(shù)制作轉(zhuǎn)基因動物，使其要求導(dǎo)入的外源基因在動物個體高水平表達所需要的新性狀。然而事與愿違的是，許多轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灦紝?dǎo)致了外源基因在哺乳動物細胞水平或動物個體水平不表達。研究表明在許多情況下外源基因整合進基因組后，其表達和轉(zhuǎn)基因沉默有關(guān)。世界各國對轉(zhuǎn)基因沉默機理及其防制展開了廣泛研究，克服轉(zhuǎn)基因沉默來提高

2、外源基因的表達己經(jīng)成為基因工程的一個重要課題。因此，有效預(yù)防轉(zhuǎn)基因沉默，對提高外源基因的表達，提高制作轉(zhuǎn)基因動物的成功率具有重要的理論和實際意義。 本研究構(gòu)建了BLG/hLF乳腺特異性表達載體BLC-14，建立了體外培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細胞(GMEC)系，并將構(gòu)建的乳腺特異性表達載體BLC-14轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞，獲得了陽性單克隆細胞株并用TSA處理，通過細胞水平的整合和表達檢測，探討了組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA能否克服轉(zhuǎn)基

3、因沉默，解除轉(zhuǎn)染入山羊乳腺上皮細胞基因組中的BLG/hLF基因表達受抑制的現(xiàn)象，從而提高BLG/hLF基因在乳腺上皮細胞中的表達水平，為研制乳腺特異性高效表達載體提供依據(jù)，為后期轉(zhuǎn)基因體細胞核移植制備高表達轉(zhuǎn)基因克隆動物乳腺生物反應(yīng)器提供具有表達潛能的體(供核)細胞。1乳腺特異性表達載體的構(gòu)建本實驗利用實驗室已有的人乳鐵蛋白eDNA、奶山羊β-乳球蛋白(p-BLG)5'端(4.2Kb)、3'端(1.8Kb)表達調(diào)控序列、Neor、增強子

4、序列構(gòu)建出了BLG/hLF乳2奶山羊乳腺上皮細胞系的建立用膠原酶消化法從經(jīng)過催乳的剛成年奶山羊或者處于泌乳中后期的青年奶山羊乳腺實質(zhì)組織中分離得到乳腺上皮細胞。采用分步消化法進行純化，經(jīng)過一到二次選擇性傳代培養(yǎng)，獲得純化的乳腺上皮細胞。用DMEM/F12+10％FCS培養(yǎng)液體外培養(yǎng)20代仍保持正常細胞繁殖擴增能力，生長良好。3 BLG/hLF基因轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞及TSA的處理BLG/hLF乳腺特異性表達載體BLC-14通過電轉(zhuǎn)染法

5、導(dǎo)入純化的Pl或者P2奶山羊乳腺上皮細胞中，共轉(zhuǎn)染5個細胞系。經(jīng)400μg．mL-1G418篩選培養(yǎng)液篩選三周后，得到有抗性的細胞株。挑取單克隆細胞株并進行擴大培養(yǎng)，共獲得89株。隨機取7株細胞DNA進行PCR檢測，結(jié)果均為陽性。將單克隆細胞株分成實驗組與對照組，實驗組加入5μM催乳素、1μMTSA的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，對照組只加入5μ催乳素的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，利用間接ELISA檢測，實驗組與對照組均獲得11株細胞能穩(wěn)定表達人乳鐵