雌激素撤退對轉(zhuǎn)染表達BRAF V600E的結(jié)腸上皮細胞生物學特征的影響.pdf

1、目的：
　　觀察雌激素水平改變對轉(zhuǎn)染表達BRAFV600E的結(jié)腸上皮細胞凋亡、細胞周期、侵襲和克隆形成能力的影響，以探討B(tài)RAFV600E突變的結(jié)腸上皮細胞在女性絕經(jīng)前后的生物學改變。
　　方法：
　　以過表達BRAFV600E質(zhì)粒和對應(yīng)空載體包裝成慢病毒感染正常結(jié)腸上皮細胞NCM460。嘌呤霉素篩選出陽性克隆(NCM-BRAFV600E、NCM-Vector)。再以正常NCM460細胞和感染了空載體質(zhì)粒的NCM460

2、細胞(NCM-Vector)作為對照，通過WB檢測感染了含BRAFV600E質(zhì)粒的NCM-BARFV600E細胞中BRAF/MEK通路激活情況，已建立NCM-BRAFV600E和NCM-Vector穩(wěn)定表達細胞株。在有或無雌激素作用于NCM-BRAFV600E和結(jié)腸癌細胞RKO的條件下，利用流式細胞術(shù)AnnexinV/PI染色和WB檢測Caspase-3、BAX、BCL2蛋白以檢測NCM-BRAFV600E和RKO細胞的凋亡情況；采用W

3、B檢測NCM-BRAFV600E和RKO細胞中細胞周期相關(guān)蛋白P27、cyclinD2的表達情況；采用WB檢測NCM-BRAFV600E和RKO細胞中E-cadherin的表達情況;采用軟瓊脂克隆形成實驗，檢測NCM-BRAFV600E在瓊脂介質(zhì)中的克隆形成能力。
　　結(jié)果：
　　相對于無雌激素作用時，在有雌激素作用時，NCM-BRAFV600 E細胞中促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、BAX表達升高，而凋亡抑制蛋白BCL-

4、2表達降低，流式細胞術(shù)同樣顯示NCM-BRAFV600E凋亡比例增加；NCM-BRAFV600E細胞中細胞周期抑制蛋白P27表達升高，而細胞周期促進蛋白cyclinD2表達降低；NCM-BRAFV600E細胞中E-cadherin表達增高；軟瓊脂介質(zhì)中NCM-BRAFV600E生長受到抑制；有或無雌激素作用于RKO，WB檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、BAX、BCL-2；細胞周期相關(guān)蛋白cyclinD2、P27；侵襲相關(guān)蛋白E-ca

5、dherin以及流式細胞術(shù)檢測凋亡均無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　結(jié)腸上皮細胞（NCM460）發(fā)生BRAFV600E突變后雌激素仍對其有促進細胞凋亡，抑制細胞周期、侵襲的作用，雌激素撤退后轉(zhuǎn)染表達BRAFV600E的結(jié)腸上皮細胞在軟瓊脂克隆形成實驗中克隆形成能力明顯增強，結(jié)果證實發(fā)生BRAF突變的結(jié)腸粘膜上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程受雌激素的抑制，絕經(jīng)后其惡變過程可能加快。本研究提示絕經(jīng)后婦女BRAF突變腫瘤發(fā)病率明顯增加的原因與雌激