奶山羊乳腺脂肪酸合酶基因表達的RNA干擾研究.pdf

1、哺乳動物的脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)利用乙酰-CoA、丙二酸單酰-CoA和NADPH等催化飽和脂肪酸的合成。山羊乳腺短、中鏈脂肪酸合成受到FAS中的乙酰/丙二酸單?；D(zhuǎn)移酶(Acctyl-CoA and malonyl-CoA transacylases，AT/MT)功能域的轉(zhuǎn)?；饔谜{(diào)控。通過調(diào)控FAS基因表達而改變山羊乳脂肪酸組成，是探討動物脂肪酸合成機理的重要方法之一。 本研究通過添加不同

2、濃度的17β-雌二醇(脂肪酸合酶基因的化學(xué)抑制劑)和RNA干擾技術(shù)抑制乳腺細胞脂肪酸合酶基因的表達，對其功能進行初步研究，為奶山羊乳腺脂肪酸合成代謝的分子機理研究提供依據(jù)。主要包括以下內(nèi)容： (1)以健康的純種西農(nóng)薩能羊為實驗動物，構(gòu)建奶山羊乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系，并對其生長特性、形態(tài)學(xué)特征、細胞遺傳和β-酪蛋白表達等相關(guān)特性進行了分析和鑒定，為研究乳腺細胞的基因功能奠定了基礎(chǔ)； (2)利用MTT法、LDH酶活性測定、

3、實時定量PCR技術(shù)、氣相色譜技術(shù)和透射電子顯微鏡研究了17β-雌二醇對山羊乳腺上皮細胞增殖分化的影響、乳腺上皮內(nèi)脂肪酸合酶基因和脂肪酸組成含量的影響以及乳腺上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響； (3)采用化學(xué)合成siRNA、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、MTT法、LDH酶活性測定、實時定量PCR技術(shù)、Western blotting和氣相色譜技術(shù)和透射電子顯微鏡等研究了沉默脂肪酸合酶基因后山羊乳腺上皮細胞的增殖及分化情況、脂肪酸組成含量以及乳腺上皮細胞超微結(jié)

4、構(gòu)的影響。 主要研究結(jié)果如下： 1.用組織塊培養(yǎng)法可獲得良好的山羊乳腺細胞原代產(chǎn)物；培養(yǎng)的山羊乳腺成纖維細胞比上皮細胞對胰蛋白酶更敏感，據(jù)此可在傳代過程中將二者分離純化，獲得純細胞系；形態(tài)學(xué)觀察表明，培養(yǎng)的細胞具有典型的上皮細胞形態(tài)學(xué)特征；染色體分析結(jié)果表明，培養(yǎng)的細胞具有正常的染色體數(shù)目；通過熒光免疫細胞染色方法鑒定了培養(yǎng)的細胞能夠表達上皮細胞特異的角蛋白5和8；該細胞在用誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)時，用實時定量PCR方法檢測到了

5、β-酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。 2.17β-雌二醇對山羊乳腺上皮細胞的增殖分化及其脂肪酸組成含量具有重要的調(diào)控作用，且其作用與濃度相關(guān)。25μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的17β-雌二醇均可顯著刺激山羊乳腺上皮細胞增殖，顯著提高乳腺上皮細胞中脂肪酸合酶基因的表達豐度，從而改變山羊乳腺上皮細胞中脂肪酸的組成含量，還可以改變?nèi)橄偕掀ぜ毎某⒔Y(jié)構(gòu)；100μmol/L的17β-雌二醇可使乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中LDH酶活力的

6、極顯著增強，從而引起乳腺上皮細胞發(fā)生嚴重的病理組織形態(tài)性損傷，顯著降低乳腺上皮細胞中脂肪酸合酶基因的表達豐度，還能誘發(fā)乳腺上皮細胞凋亡。 3.沉默山羊乳腺上皮細胞脂肪酸合酶基因，可抑制乳腺上皮細胞的增殖，增加乳腺上皮細胞的形態(tài)損傷，改變?nèi)橄偕掀ぜ毎械闹舅峤M成含量，短鏈脂肪酸的百分含量極顯著下降，中鏈脂肪酸的百分含量顯著升高，長鏈脂肪酸的百分含量略有變化，并誘發(fā)乳腺上皮細胞發(fā)生凋亡，產(chǎn)生凋亡小體，同時，線粒體也出現(xiàn)腫脹，破裂現(xiàn)