實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速定量檢測H3N2、H1N1和H1N2亞型豬流感病毒.pdf

1、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存的A/Swine/GLlangdong/9/2005(H3N2)、A/Swine/Guangxi/12/2005(H1N1)和A/Swine/Tianjin/1/2007(H1N2)毒株序列和GenBank中已公布的豬流感病毒H3N2、H1N1和H1N2亞型的H3、N2、H1、N1和M的編碼基因，設(shè)計(jì)了五對引物(M、H3、N2、H1和N1)和五條TaqMan MGB探針，RT-PCR擴(kuò)增豬流感病毒A/Swine/Guan

2、gdong/9/2005(H3N2)的M、H3、N2基因和A/Swine/Guangxi/12/2005(H1N1)的H1、N1基因，擴(kuò)增片段與載體pMD18-T的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH-5α，重組質(zhì)粒pMD-M、pMD-H3、pMD-N2、pMD-H1和pMD-N1經(jīng)PCR鑒定后測序，DNAStar軟件分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中連入的M、H3、N2、H1、N1基因與本實(shí)驗(yàn)室保存的豬流感病毒A/Swine/Guangdong/9

3、/2005(H3N2)和A/Swine/Guangxi/12/2005(H1N1)的核苷酸序列同源性在97.5％以上，從而從分子水平上確定重組質(zhì)粒中連入基因的正確性。在M基因單項(xiàng)Real-time PCR檢測實(shí)驗(yàn)中，通過對引物和探針濃度、Mgcl2濃度、dNTP濃度、循環(huán)次數(shù)、退火溫度的一系列優(yōu)化比較，建立了最佳的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)均勻一致等反應(yīng)條件后，建立了Real-time PCR診斷方法，同時(shí)應(yīng)用于H3、N2、H1

4、、N1基因的檢測。 為使建立的方法在檢測病毒同時(shí)又能量化樣品中病毒含量，使用含有選定檢測序列的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明該方法的靈敏度為100拷貝/反應(yīng)，對豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬圓環(huán)病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果無交叉反應(yīng)，特異性好、重復(fù)性佳。最后，用建立的熒光定量PCR方法對19份人工攻毒樣品和30份現(xiàn)地樣品進(jìn)行檢測并同時(shí)進(jìn)行病毒分離，結(jié)果表明，熒光定量PCR方法和病毒分離