SYBR Green實(shí)時(shí)PCR檢測甲型H1N1與季節(jié)性流感病毒方法的建立.pdf

1、目的:建立一種檢測甲型H1N1、季節(jié)性H1N1、H3N2和乙型流感病毒的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與多重PCR法，并將建立的方法進(jìn)行初步臨床應(yīng)用。
　　 方法:1.設(shè)計(jì)針對甲型H1N1、季節(jié)性H1N1、H3N2與乙型流感病毒HA基因的引物，分別進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，用人的GAPDH基因作為內(nèi)參判斷標(biāo)本來源和實(shí)施質(zhì)量控制的依據(jù)，同時(shí)進(jìn)行熔解曲線和Tm值分析。優(yōu)化熒光定量PCR的反應(yīng)體系與

2、反應(yīng)條件，檢測該方法的敏感性，特異性和重復(fù)性并進(jìn)行盲樣檢測評價(jià)實(shí)驗(yàn)。2.利用以上四對引物，建立可同時(shí)擴(kuò)增出四個(gè)流感病毒特異性片段的多重PCR的方法，并進(jìn)行敏感性、特異性和盲樣檢測評價(jià)實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果:1.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR構(gòu)建的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率為:95.588％，檢測靈敏度為101copies/反應(yīng)，從病毒核酸提取到檢測完成需3.5小時(shí)，重現(xiàn)性好。該方法與H5、

3、H7、H9亞型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均無交叉反應(yīng)，成功地驗(yàn)證性檢驗(yàn)了32份盲樣標(biāo)本。2.多重PCR可同時(shí)擴(kuò)增出流感病毒亞型的HA基因片段長度分別為106bp(甲型H1N1)，135bp(季節(jié)性H1N1)，118bp(季節(jié)性H3N2)，170bp（乙型流感病毒）。該實(shí)驗(yàn)檢測甲型H1N1(A/colifornia/07/2009)的靈敏度為102copies/反應(yīng)。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每對引物只檢測對應(yīng)的病毒，32份盲樣檢測結(jié)果特異