部分遺傳性出血性疾病的基因診斷及分子發(fā)病機制研究.pdf

1、本研究對1例遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥家系和5例遺傳性血小板無力癥家系分別進行了F7基因、αⅡb基因和β3基因的研究，并對所發(fā)現(xiàn)的F7基因的剪接位點突變IVS5-1 G>A進行了異位轉錄和體外表達研究，以探討其導致遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥的分子發(fā)病機制。 凝血因子Ⅶ（FⅦ）是主要由肝臟合成的依賴維生素K的凝血因子，它不僅是外源性凝血途徑的啟動因子，在內(nèi)源性凝血途徑中也起著重要的作用。遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥是常染色體隱性遺傳性疾病，其發(fā)

2、病機制主要是由于F7基因異常，致使血漿中FⅦ功能發(fā)生障礙和（或）含量減少，從而發(fā)生出血癥狀。本研究對1例遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥的家系進行了表型診斷、家系調(diào)查、基因診斷和發(fā)病機制的研究。此家系先證者有反復血尿、牙齦出血和口腔粘膜出血癥狀；表型檢測顯示其APTT正常，PT延長，F(xiàn)Ⅶ:C和FⅦ:Ag都降低（分別為4.4％和38.5％）；F7基因分析顯示其帶有2種不同形式的雜合突變，即錯義突變10902T>G導致Cys329Gly以及剪接位點突

3、變IVS5-1G>A。家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其父母為F7基因缺陷的雜合子，臨床無出血表現(xiàn)；先證者胞姐帶有與先證者同樣的復合雜合突變，有月經(jīng)過多及皮膚粘膜出血癥狀。 IVS5-1G>A是國際首次報道的F7基因突變。為研究其對FⅦ mRNA剪接的影響，本研究利用逆轉錄結合巢式PCR的方法分析患者外周血白細胞的FⅦ異位轉錄本，結果只檢測到正常轉錄本。此后，進行了體外轉錄研究，PCR擴增F7基因第4到第7號內(nèi)含子片段，構建第5號內(nèi)含子-1位含A

4、的突變型質粒和含G的野生型質粒，將2種質粒分別轉染HEK293T細胞，抽提RNA，RT-PCR后克隆入pcDNA3.1(-)進行測序，結果在轉染了野生型質粒的細胞總RNA中F7基因的5、6、7號外顯子能正常剪接，而轉染了突變型質粒的細胞總RNA中發(fā)生了F7基因6號外顯子缺失。F7基因的6號外顯子缺失，導致讀碼框移位，在FⅦ Thr130后編碼了53個不同的氨基酸后提前產(chǎn)生終止密碼。提前產(chǎn)生的終止密碼在體內(nèi)通常會通過無義突變介導的mRNA

5、降解機制介導相應mRNA的降解。因此，缺失了6號外顯子的FⅦ異常轉錄本，由于帶有提前終止密碼子而使其在體內(nèi)快速降解，從而不會有翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生，導致了遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥的發(fā)生。 遺傳性血小板無力癥是一種少見的常染色體隱性遺傳的血小板功能缺陷性疾病，其特點是由于血小板膜αⅡb或（和）β3的數(shù)量或（和）質量異常而引起血小板對多種生理激動劑的誘聚反應缺乏或明顯降低，患者常終身存在出血傾向，主要表現(xiàn)為皮膚粘膜出血。本病可分為I、II、

6、III三型：I型占大多數(shù)(78％)，血小板表面αIIbβ3<正常的5％；II型占14％，血小板表面αIIbβ3為正常的10％～20％；III型，又稱變異型，占8％，血小板表面αIIbβ3為正常的50％～100％。I型和II型血小板無力癥是由血小板表面αIIbβ3數(shù)量的減少所致，而變異型血小板無力癥是由血小板表面αIIbβ3質的異常所致。?、騜β3復合物是由一雙鏈的αⅡb亞基與一單鏈的β3亞基經(jīng)非共價鍵結合而成的異源二聚體，為血小板膜上最

7、多的一種糖蛋白，屬于整合素家族，是纖維蛋白原和多種黏附蛋白的受體，在加速血小板血栓形成中起著重要作用。ΑⅡb和β3分別由單獨的基因編碼，大部分αⅡb或（和）β3基因的異常會導致αⅡbβ3復合物的膜表達量缺乏或減少，有少數(shù)基因異常只引起αⅡbβ3復合物功能下降而表達量基本正常。 本研究對5例遺傳性血小板無力癥家系進行了表型診斷、家系調(diào)查和基因診斷研究。通過血小板聚集試驗及全血法流式細胞術檢測明確臨床診斷；PCR擴增先證者αⅡb及β

8、3基因的全部外顯子及其側翼序列，用末端標記雙脫氧法測序。含雜合缺失突變的外顯子通過構建TA克隆及測序以證實。新的基因改變在100例正常人相應區(qū)域進行基因多態(tài)性的篩查。家系成員DNA則僅在先證者αⅡb基因或β3基因突變區(qū)域進行擴增和測序。研究顯示，5例家系的先證者均表現(xiàn)為出血時間延長；全血涂片上血小板散在不聚集；二磷酸腺苷、腎上腺素、膠原、花生四烯酸等多種誘聚劑誘導的血小板聚集反應均低下，而瑞斯托霉素誘導的血小板聚集反應基本正常；流式檢測

9、顯示家系1、家系2、家系4和家系5先證者的血小板膜表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)表達基本缺失，診斷為Ⅰ型血小板無力癥；家系3先證者血小板膜表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)陽性的血小板百分率分別為88.5％和99.5％，診斷為Ⅲ型血小板無力癥。對先證者及其家系成員的基因分析顯示，家系1、2、3和5的先證者αⅡb基因中均帶有復合雜合突變，分別為1750C>T（Arg553Stop）和2671C>T（Glu48Stop）、2

10、35G>T（Glu48Stop）和2671C>T、1084T>C（Phe331Leu）和1772A>C（Asp560Ala）、2333A>C（Gln747Pro）和3060G>C（Lys989Asn或剪接異常）；家系4先證者αⅡb基因的1號外顯子存在純合缺失突變69-79del，導致移碼突變，終止密碼提前。通過5個GT家系的基因診斷研究，共發(fā)現(xiàn)了8種發(fā)生于αⅡb基因的突變，其中235G>T（Glu48Stop）、1084T>C（Phe3