M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相關(guān)研究——TCRγδ配體或腫瘤生物標(biāo)志物的鑒定.pdf

1、γδT細(xì)胞受體(TCRγδ)所識(shí)別的配體至今僅有較少的被鑒定。近年來,我們實(shí)驗(yàn)室利用TCRδ鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3δ)多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)體系成功發(fā)現(xiàn)和鑒定了一些TCRγδ新配體,為全面闡明γδT細(xì)胞功能奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 M2型丙酮酸激酶(PKM2)是本課題組前期以O(shè)T3肽(來自卵巢癌γδTIL的CDR3δ的一個(gè)優(yōu)勢(shì)序列)為探針,從卵巢癌細(xì)胞蛋白提取液中篩選到的蛋白之一,在腫瘤細(xì)胞中有高水平表達(dá)。本研究的第一部分是采取多種方法對(duì)

2、PKM2的結(jié)合特性、細(xì)胞定位及其對(duì)γδT細(xì)胞的刺激活性檢測(cè)進(jìn)行了初步研究,以確定其是否為TCRγδ的新配體。
　　 我們采用Western blot的方法驗(yàn)證與PKM2結(jié)合；用Westernblot及免疫組化的方法觀察PKM2在腫瘤細(xì)胞及組織中的表達(dá)；用流式細(xì)胞術(shù)及激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù)的方法驗(yàn)證PKM2在腫瘤細(xì)胞的定位；用固相化PKM2體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞和PKM2刺激γδT。細(xì)胞分泌IFN-γ的實(shí)驗(yàn),檢驗(yàn)PKM2的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)

3、果表明:PKM2可與OT3肽結(jié)合,腫瘤細(xì)胞總蛋白提取物中含有大量PKM2,提示以O(shè)T3為探針,從腫瘤細(xì)胞總蛋白提取物中釣取到PKM2是合理的,用此方法篩選OT3結(jié)合蛋白的方法是可行的；PKM2普遍表達(dá)于腫瘤細(xì)胞及組織,但不表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜；PKM2在體外不能擴(kuò)增γδT細(xì)胞,無刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的功能。提示,PKM2不表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面,對(duì)γδT細(xì)胞不具有刺激活化的功能,PKM2不具備TCRγδ配體的特性。但免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示

4、PKM2在腎癌、直腸癌和肺癌有高表達(dá),提示其有成為腫瘤生物標(biāo)記物的臨床價(jià)值。
　　 本研究第二部分工作是制備PKM2的單克隆抗體,以期為驗(yàn)證PKM2為腫瘤標(biāo)記物提供必要的試劑。
　　 我們以原核表達(dá)的rhPKM2蛋白為免疫原,免疫BALB/C小鼠,用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗體的效價(jià)；用雜交瘤技術(shù),取免疫小鼠的脾細(xì)胞,與SP20進(jìn)行細(xì)胞融合；用甲基纖維素半固體HAT培養(yǎng)基法培養(yǎng)融合后的雜交瘤細(xì)胞,用ELISA法篩選出陽(yáng)

5、性克隆,用Western blot法鑒定其結(jié)合特異性,用Rrotein G親和層析株純化單抗,并與HRP偶聯(lián),進(jìn)而探索定量檢測(cè)PKM2 ELISA試劑盒的制備。結(jié)果我們成功制備出了PKM2的多株單抗,有三株可用于Western blot實(shí)驗(yàn),隨后成功生產(chǎn)純化并用HPR標(biāo)記了兩株單抗(5-G10和4-D10),進(jìn)而,進(jìn)行了雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)PKM2的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明有陽(yáng)性結(jié)合反應(yīng)。本研究為后續(xù)研發(fā)定量檢測(cè)PKM2的ELISA試劑盒