惡性腫瘤個體化治療相關(guān)生物標志物的篩選研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類健康的常見疾病,位居人類疾病三大主要死亡原因之首,占所有疾病死因的四分之一。多年來,惡性腫瘤的治療手段保持著以手術(shù)為主輔以全身的化療和局部放療的綜合治療模式；近年來,腫瘤學家認識到由于個體腫瘤的生物遺傳異質(zhì)性以及個體間的遺傳差異性決定了不同患者對同一腫瘤治療方案表現(xiàn)不同的反應性。對這些差異的理解使我們在腫瘤治療策略上產(chǎn)生革命性的變化即腫瘤的個體化治療,腫瘤個體化治療是對每一個腫瘤患者“量體裁衣”,根據(jù)每個個體腫瘤生物學

2、特征以及基因組學和轉(zhuǎn)錄組學上的差異進行針對性的治療,使療效最大化和毒性最低化。
　　 惡性腫瘤藥物治療包括化學治療和靶向治療。傳統(tǒng)的腫瘤化學治療存在治療的靶向不明確、選擇性不強和易產(chǎn)生耐藥等特點,導致其有效率低和在殺傷腫瘤細胞的同時損害正常組織細胞等缺點,然而如何實現(xiàn)傳統(tǒng)化療對腫瘤患者的個體化治療是目前腫瘤學家需要深入研究的問題,目前在一些惡性腫瘤的化療中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因的多態(tài)性和表達狀況與某些化療藥物的療效以及副反應有一定的相

3、關(guān)性,可以用來指導化療藥物的選擇。
　　 隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制認識的不斷深入和分子生物學技術(shù)的發(fā)展,針對腫瘤細胞受體、信號傳導和血管生成等關(guān)鍵分子的分子靶向治療已成為腫瘤藥物治療領(lǐng)域的一個新的方向,是腫瘤個體化治療理念的一個重要典范。靶向治療是指抗腫瘤藥物靶向性地與腫瘤的不同特性靶標位點發(fā)生作用而殺死腫瘤細胞,靶向治療對正常組織影響較小,是目前最理想的腫瘤治療模式。
　　 因此在本研究中,我們以我國常見的兩種惡性腫

4、瘤,結(jié)直腸癌和肺癌為例,應用表面加強激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(Surface Enhanced LaserDesorption／Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,SELDI—TOF—MS)蛋白質(zhì)指紋圖譜分析技術(shù),在血清中尋找可以預測兩種腫瘤常用化療藥物療效的蛋白標志物；在結(jié)直腸癌組織標本中,應用焦磷酸鹽測序法分析抗EGFR單克隆抗體靶向治療分子標志K-ras基因的突變狀況及其與臨床

5、病理因素的相關(guān)性。
　　 第一部分晚期結(jié)直腸癌化療療效預測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的初步研究。
　　 1、應用SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)學技術(shù),分析晚期結(jié)直腸癌患者42例化療受益者與28例無效者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異,篩選出10個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9286m／z、9431m／z、9375m／z、9298m／z、4304m／z,9352m／z,9404m／z,4606m／z,9198m／z,3963m／z)組合所構(gòu)建而

6、成的結(jié)直腸癌化療療效預測模型,其總準確率為90.0％(63／70),靈敏度為90.7％(39／43),特異度為88.9％(24／27)。這些蛋白質(zhì)峰均在化療受益組表達高于化療無效組。
　　 2、應用SELDI-TOF—MS蛋白質(zhì)學技術(shù),分析29例接受FOLFOX化療方案受益者與15例無效者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異,篩選出6個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9298m／z、9282m／z、4606m／z、9198m／z、7775m／z,2266m

7、／z)組合所構(gòu)建而成的FOLFOX方案化療的化療療效預測模型總準確率為88.6％(39144),靈敏度為92.9％(26／28),特異度為81.3％(13／16)。其中2266m／z這個峰在化療受益者中低表達；9298 m／z、9281 m／z、4606m／z、9198m／z、7775m／z這5個峰在化療受益者中高表達。
　　 3、應用SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)學技術(shù),分析13例接受FOLFIRI方案化療受益者與13例無效者

8、血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異,篩選出7個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為4321m／z、4305m／z、2648m／z、2952m／z、4121m／z,4292m／z,3980 m／z)組合所構(gòu)建而成的結(jié)直腸癌FOLFIRI方案化療的療效預測模型總準確率為92.3％(24／26),靈敏度為92.3％(12／13),特異性為92.3％(12／13)。其中2648m／z,2952m／z,4121m／z這3個峰在化療受益者中低表達,4321 m／z、4305m／

9、z、4292 m／z、3980m／z這3個峰在化療受益者中高表達。
　　 第二部分晚期非小細胞肺癌化療療效預測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的初步研究。
　　 通過對晚期非小細胞肺癌患者中35例化療受益者與12例無效者血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較,共檢測到表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的蛋白質(zhì)峰11個。通過交叉驗證,判別分析軟件篩選出8個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為4353m／z、2970m／z、2957m／z、4292m／z、394

10、3m／z,2961m／z,4121m／z,2000m／z)組合所構(gòu)建而成的NSCLC化療療效預測模型的準確率為95.7％。其中4353m／z、2970 m／z、2957 m／z、4292 m／z、3943 m／z、2961 m／z、4121 m／z這7個峰在晚期非小細胞肺癌患者化療受益者血清中表達高于無效者；2000m／z這個峰在非小細胞肺癌患者化療受益者血清中表達低于無效者。
　　 第三部分 K-ras和BRAF基因突變及其與

11、結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系研究。
　　 選取118例均經(jīng)病理證實的結(jié)直腸癌腫瘤組織標本。焦磷酸鹽測序法檢測K-ras基因第1外顯子第12、13和61密碼子以及BRAF基因第600密碼子突變狀況,并分析K—ras基因突變與病人年齡、腫瘤部位、分化程度、臨床分期、pT及pN以及預后的相關(guān)性。
　　 1、在40例結(jié)直腸癌標本中,分別應用PCR-直接測序法和焦磷酸鹽測序法檢測K-ras基因第1外顯子第12和13密碼子突變,比較兩

12、種方法的檢出率、靈敏度,40例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織經(jīng)常規(guī)PCR擴增后直接測序無一例發(fā)現(xiàn)K-ras基因第12、13密碼子的突變；經(jīng)焦磷酸測序法檢測發(fā)現(xiàn),11例含有K-ras基因第12密碼子突變,2例含有K-ras基因第13密碼子突變,總突變檢測率32.5％(13／40)。
　　 2、118例結(jié)直腸癌組織標本經(jīng)焦磷酸鹽測序法檢測共發(fā)現(xiàn)突變41例,突變率為34.7％(41／118),其中第12密碼子突變28例,突變率為23.7％(2

13、8／118)；第13密碼子突變12例,突變率為10.2％(12／118)；第61密碼子突變僅1例(0.8％,1／118)；僅有2個患者被檢測到15外顯子的第600密碼子的BRAF基因突變。
　　 3、K—ras突變與性別存在顯著的相關(guān)性,女性結(jié)直腸癌病人組織中K-ras基因突變明顯高于男性(44.7％vs28.2％,P=0.037),女性直腸癌患者組織中K-ras基因突變率高于男性(34.O％vs11.2％,P<0.05),而男

14、性結(jié)腸癌患者組織中K-ras基因突變率則高于女性(16.9％vs10.6％,P<0.05)。
　　 4、野生型K-ras結(jié)直腸癌患者的中位生存時間為84.0個月,較突變型K-ras患者的中位生存期(63.0月)要稍高,然而差異不顯著(P=0.25)；K-ras第12、13密碼子突變患者的中位生存期分別為45.0月和63.0月；而第61密碼子突變患者的中位生存期則較長,為73.0月,然而沒有數(shù)據(jù)表明K-ras基因第12、13和61

15、密碼子突變與患者生存期之間存在顯著的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、10個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9286m／z、9431m／z、9375m／z、9298m／z、4304m／z,9352m／z,9404m／Z,4606m／z,9198m,z,3963m／z)組合所構(gòu)建而成的模型可以預測晚期結(jié)直腸癌化療療效,其準確率為90.0％；
　　 2、6個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9298m／z、9282m／z、4606m／z、9198

16、m／z、7775m／z,2266m／z)組合所構(gòu)建而成的模型可以預測晚期結(jié)直腸癌FOLFOX方案的化療；
　　 療效,準確率為88.6％；
　　 3、7個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為4321m／z、4305m／z、2648m／z、2952m／z、4121m／z,4292m／z,3980 m／z)組合所構(gòu)建而成的模型可以預測晚期結(jié)直腸癌FOLFIRI化療方案的療效,準確率為92.3％；
　　 4、8個蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為435

17、3m／z、2970m／z、2957m／z、4292m／z、3943m／z,2961m／z,4121m／z,2000m／z)組合所構(gòu)建而成的晚期NSCLC化療療效預測模型的準確率為95.7％；
　　 5、與目前臨床基因突變檢測的經(jīng)典方法-PCR產(chǎn)物直接測序方法相比,焦磷酸鹽測序法能快捷、靈敏地檢測出結(jié)直腸癌組織中K-ras基因的突變,可作為K-ras；
　　 基因臨床常規(guī)突變檢測方法推廣；
　　 6、在中國人群中,