頭頸惡性腫瘤和鼻息肉中標(biāo)志物的檢測及hNESPCs生長動力學(xué)研究.pdf

1、第一部分:喉和下咽鱗狀細(xì)胞癌中SIRT1、DBC1及HIC1的表達(dá)和臨床意義
　　研究背景:頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是世界上第六大常見的惡性腫瘤，其中約1/4是喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)。相比之下，下咽鱗狀細(xì)胞癌(HSCC)的發(fā)病率要比LSCC低得多，但相當(dāng)多的HSCC患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，往往已發(fā)生臨近部位侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這些患者的預(yù)后很差。目前雖然可以采取手術(shù)治療輔以放射治療或化學(xué)藥物等治療方法，近年來LSCC和HS

2、CC患者的無瘤生存率仍然沒有明顯的改觀。如果能找到可以監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的標(biāo)志物，將會提高LSCC和HSCC患者的生存率和生活質(zhì)量。近年來，腫瘤標(biāo)志物的檢測已經(jīng)成為熱點(diǎn)。
　　SIRT1，又名Sirtuin1，是一種NAD+依賴的去乙?；?，參與多種生命過程，并且可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，SIRT1在多種腫瘤中表達(dá)增高，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、大B細(xì)胞淋巴瘤、急性髓性白血病和Bowen氏病等。

3、然而，也有人報(bào)道SIRT1在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)低于正常對照組。目前為止，SIRT1在LSCC和HSCC的表達(dá)情況尚無報(bào)道。DBC1(DeletedinBreastCancer1)是SIRT1的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，一些研究表明DBC1可以通過特異性抑制SIRT1的活性來促進(jìn)p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，也是因?yàn)檫@個(gè)原因，DBC1被認(rèn)為是腫瘤抑制劑。然而，另外一些研究表明，DBC1在乳腺癌和結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)它還促

4、進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生存，從這個(gè)角度講，DBC1可能在乳腺癌和結(jié)直腸癌中起著促癌基因的作用。因此DBC1在惡性腫瘤中的具體作用還存在爭議，有待進(jìn)一步研究確定。HIC1(HypermethylatedInCancer1)是一種抑癌基因，它在乳腺癌、胃癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、生殖細(xì)胞腫瘤、白血病、大B細(xì)胞淋巴瘤、兒童髓母細(xì)胞瘤和室管膜瘤等腫瘤中表現(xiàn)為表觀遺傳學(xué)上的沉默。SIRT1是HIC1的一個(gè)作用靶點(diǎn)，人類髓

5、性白血病中HIC1的滅活可以導(dǎo)致SIRT1對p53的活性抑制，進(jìn)而引起細(xì)胞生存和凋亡的改變，p53反過來又可以直接激活HIC1的轉(zhuǎn)錄過程，因此，SIRT1、DBC1和HIC1在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用，并可能存在著重要的聯(lián)系。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本課題的研究目的是了解這些新型標(biāo)志物（SIRT1、DBC1和HIC1）在喉鱗狀細(xì)胞癌和下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，這三個(gè)標(biāo)志物之間的相關(guān)性以及它們與這兩種惡性腫瘤的臨床病

6、理特征之間的關(guān)聯(lián)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:用實(shí)時(shí)定量PCR方法測定了54對腫瘤標(biāo)本和癌旁黏膜中SIRT1，DBC1和HIC1mRNA的表達(dá)情況并用配對Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;用免疫組織化學(xué)染色的方法測定了120例腫瘤和54例癌旁黏膜中SIRT1，DBC1和HIC1的蛋白表達(dá)并采用獨(dú)立樣本Mann-Whitney雙尾檢驗(yàn)進(jìn)行分析:另外，用Spearman等級分析來研究mRNA水平各標(biāo)志物之間的相關(guān)性，分析這些標(biāo)志物和臨床

7、病理特征之間的關(guān)系時(shí)采用Pearson卡方檢驗(yàn)。最后采用LogRanktest方法進(jìn)行了生存分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在mRNA水平上，SIRT1和HIC1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯降低，而DBC1的mRNA在腫瘤組織中則比對照組顯著增高;Spearman等級分析結(jié)果顯示在腫瘤組織和癌旁黏膜組織（對照組）中SIRT1與DBC1、HIC1存在明顯正相關(guān)關(guān)系，而DBC1和HIC1之

8、間無明顯相關(guān)性。
　　在蛋白水平上，SIRT1表達(dá)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而DBC1和p53則主要在細(xì)胞核中表達(dá);SIRT1在61％(34/54)的癌旁黏膜中高表達(dá)，而僅在31％(37/120)的腫瘤標(biāo)本中高表達(dá);有趣的是，DBC1在93％(50/54)的癌旁黏膜中高表達(dá)，而僅在43％(52/120)的腫瘤標(biāo)本中高表達(dá);統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，SIRT1和DBC1蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)都比對照組明顯降低;SIRT1蛋白表達(dá)與腫瘤的TNM分期

9、(p=0.005)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.021)有關(guān)系，DBC1蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度(p-0.026)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.013)和p53的表達(dá)(p=0.009)有關(guān)系。
　　本課題中共包括120例惡性腫瘤患者（59例為喉鱗狀細(xì)胞癌，61例為下咽鱗狀細(xì)胞癌），其中9例失訪，隨訪結(jié)束時(shí)，58例患者死亡，53例仍生存。我們采用LogRanktest方法進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)在早期惡性腫瘤患者中，SIRT1和DBC1與患者的生存率相

10、關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:三種新型標(biāo)志物（SIRT1、DBC1和HIC1）在喉和下咽鱗狀細(xì)胞癌中（LSCC和HSCC）都發(fā)揮著抑癌基因的作用，SIRT1和DBC1與LSCC和HSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在早期惡性腫瘤中，SIRT1和DBC1與患者的生存率相關(guān)。此外，HIC1在mRNA水平與SIRT1關(guān)系密切。這三種新型標(biāo)志物有可能成為喉和下咽鱗狀細(xì)胞癌的篩選指標(biāo)和評估患者預(yù)后的指標(biāo)，并可能成為抗腫瘤藥物治療的新靶點(diǎn)。
　　第二部分:

11、鼻息肉中標(biāo)志物的檢測
　　研究背景:鼻息肉(NP)是上呼吸道常見的一種慢性炎癥，常伴有炎癥細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，以及異常組織重塑。盡管目前有很多關(guān)于鼻息肉基因表達(dá)的研究，其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。我們之前的基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NP中EMP1、EGF和NRG3等標(biāo)志物表達(dá)明顯降低。上皮膜蛋白1(EMP1)是一種完整的膜糖蛋白，最早是在胃腸道、皮膚、肺以及腦組織中檢測到的，可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的生長和分化

12、。EGF和NRG3是表皮生長因子受體（ERBB家族）的配體，ERBB家族包括EGFR，ERBB2，ERBB3和ERBB4，它們的配體除了EGF和NRG3外，還有AREG，HBEGF，TGF-α和其它NRGs等。EGF（表皮生長因子）是由Cohen等人發(fā)現(xiàn)的，它參與很多生命過程。NRGs（神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白）是細(xì)胞間的信號蛋白，包括NRG1，NRG2，NRG3和NRG4，這些神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白具有類似EGF的結(jié)構(gòu)域。EMP1和EGF-ERBB家族在N

13、P中的表達(dá)情況以及在上皮組織重塑中的作用尚不明確。
　　糖皮質(zhì)激素是目前為止控制鼻息肉炎癥的最有效的藥物治療措施，可以明顯抑制嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤。也有人提出糖皮質(zhì)激素在促進(jìn)上皮修復(fù)和控制組織重塑中發(fā)揮著重要作用。它可以使與上皮修復(fù)有關(guān)的AP-1及相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)可以使鼻息肉中與組織重塑有關(guān)的基因p63的表達(dá)下降，有研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素通過EGF/EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來影響鼻息肉和哮喘患者的上皮修復(fù)和組織重塑過程。
　　

14、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本課題的目的是研究EMP1和EGF-ERBB家族在鼻息肉中的表達(dá)情況，它們在鼻息肉上皮組織重塑中的作用及對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:用實(shí)時(shí)定量PCR方法測定了55例未經(jīng)激素治療的鼻息肉組織(GC-Na(i)veNP)和30例下鼻甲對照組織中EMP1和EGF-ERBB家族mRNA的表達(dá)情況并采用Mann-Whitney雙尾檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;激素治療前后鼻息肉組織(18對)中各標(biāo)志物mRNA的比較采用配對Wilc

15、oxon符號秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;另外用Spearman等級分析來研究mRNA水平各標(biāo)志物之間的相關(guān)性。用免疫組織化學(xué)染色的方法測定了10例GC-Na(i)veNP樣本和10例對照組IT樣本中EMP1蛋白的表達(dá);所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，當(dāng)p＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:EMP1的mRNA在GC-Na(i)veNP組中明顯低于對照組;激素治療后，EMP1的表達(dá)明顯增高;伴有重度上皮增生的NP組中EMP1表達(dá)水平

16、明顯低于輕-中度上皮增生組，伴有鱗狀上皮化生的NP組中EMP1表達(dá)明顯低于不伴鱗狀上皮化生組;EMP1與AP-1相關(guān)的基因呈正相關(guān)。另外在10例GC-Na(i)veNP樣本和10例對照組的IT樣本中測定了EMP1蛋白的表達(dá)，GC-Na(i)veNP組中的EMP1蛋白表達(dá)明顯低于對照組，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果提示EMP1在基底細(xì)胞和分化細(xì)胞中都有表達(dá)。
　　EGF-ERBB家族8個(gè)成員在GC-Na(i)veNP組織中的表達(dá)明顯低于對照

17、組并且差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中EGF和NRG3在兩組之間的差異最為顯著，分別達(dá)26.32和37.91倍之多（p值均小于0.001）;經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后EGF和NRG3表達(dá)明顯增高，它們相關(guān)的4個(gè)受體（ERBB2、ERBB3、ERBB4和EGFR）表達(dá)也有不同程度的增加。Spearman等級分析顯示EGF和NRG3之間存在密切正相關(guān)關(guān)系(r=0.621)，AREG和HBEGF之間存在密切正相關(guān)關(guān)系(r=0.911)，EGF與ERBB2、E

18、RBB3和ERBB4存在關(guān)聯(lián)（r值分別為0.484，0.422和0.435），NRG3與4個(gè)受體也都呈正相關(guān);EGF-ERBB家族與AP-1家族中的一些標(biāo)志物呈正相關(guān);與嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的一些標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān);與T輔助細(xì)胞相關(guān)的一些標(biāo)志物呈正相關(guān);EGF-ERBB家族中一些標(biāo)志物還與CXCL12、CXCR4和CDKN1A呈正相關(guān)關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:EMP1可以作為判定慢性呼吸道炎癥性疾?。ū窍⑷獾龋┲杏袩o存在異常上皮組織重塑和鱗狀

19、上皮化生的特異性指標(biāo)。EGF-ERBB家族可能參與了鼻息肉上皮損傷和修復(fù)的過程。EMP1和EGF-ERBB家族可能在鼻上皮細(xì)胞的生長和分化中發(fā)揮著重要的作用。
　　第三部分:鼻上皮干/祖細(xì)胞生長動力學(xué)的研究
　　研究背景:健康人的鼻黏膜上皮包含四種細(xì)胞類型:基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。通常認(rèn)為基底細(xì)胞具有干細(xì)胞和祖細(xì)胞的特性，它具有自我更新和分化能力，可以分化為其它幾種上皮細(xì)胞，如杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞等。在此前的研

20、究中，我們已成功分離并培養(yǎng)來自鼻息肉(NP)和下鼻甲(IT)組織的鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)。
　　目前已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于鼻息肉粘膜上皮的研究大都是鼻息肉上皮的病理學(xué)改變，以及相應(yīng)的分子標(biāo)志物和基因調(diào)控等研究，而無人報(bào)道體外鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)的生物學(xué)特性。我們的研究是基于這樣一個(gè)假設(shè):鼻息肉和健康鼻黏膜上皮之間存在內(nèi)在表型差異。這項(xiàng)研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)體系研究鼻上皮干/祖細(xì)胞的生長和增殖特性，進(jìn)而比較鼻息肉和健

21、康鼻黏膜上皮來源的鼻上皮干/祖細(xì)胞生長和增殖特性的差異。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本課題的目的是體外研究鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)的生物學(xué)特性，并比較鼻息肉和對照組來源的hNESPCs克隆形成率和倍增時(shí)間的差異，以及體外培養(yǎng)的hNESPCs中p63及Ki67等標(biāo)志物的表達(dá)等。
　　實(shí)驗(yàn)方法:鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)經(jīng)過分離后，在培養(yǎng)過程中計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間和克隆形成率;觀察衰老相關(guān)標(biāo)志物β-半乳糖苷酶在細(xì)胞克隆中的染色

22、情況:通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況;實(shí)時(shí)定量PCR測定p63和Ki67在鼻息肉和對照組中的表達(dá)情況;最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Spearman等級分析來研究mRNA水平各標(biāo)志物之間的相關(guān)性;Linearmixedmodels用來估計(jì)NP和對照組之間倍增時(shí)間和克隆形成率的差異;Mann-Whitney分析鼻息肉和對照組組織和細(xì)胞中Ki67+/p63+比例的差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，當(dāng)p＜

23、0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:鼻息肉和對照組來源的hNESPCs具有相似的生長模式;兩組不同來源的細(xì)胞之間，在p0和p1兩代時(shí)無明顯形態(tài)學(xué)差異，而到了p2和p3時(shí)，NP來源的hNESPCs細(xì)胞出現(xiàn)了較多分化和衰老的細(xì)胞，顯微鏡下呈現(xiàn)“荷包蛋”樣外觀，這些細(xì)胞中β-半乳糖苷酶染色陽性，表明細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的衰老狀態(tài)。對照組來源的細(xì)胞在傳代過程中生長增殖速度明顯比鼻息肉組來源的細(xì)胞快，表現(xiàn)為對照組來源的細(xì)胞克隆形成率

24、(CFE)更高，倍增時(shí)間更短。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(LinearMixedModels)得出兩種不同來源的細(xì)胞在p1和p2兩代中有顯著性差異。通過標(biāo)準(zhǔn)差分析發(fā)現(xiàn)NP來源的細(xì)胞倍增時(shí)間和克隆形成率的變異也較大。
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:從p0到p2，鼻息肉和對照組來源的鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)p63mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在兩種不同來源的細(xì)胞中，從p1到p2，Ki67的表達(dá)呈下降趨勢。在p1和p2兩代，鼻息肉來源的hNE

25、SPCs中Ki67mRNA的表達(dá)低于對照組。對照組來源的細(xì)胞不同代之間Ki67的表達(dá)較穩(wěn)定，從p1到p3，Ki67+/p63+的比例在77％到93％之間。而NP來源的細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長，Ki67的表達(dá)逐漸下降，從p1到p3，Ki67+/p63+的比例分別為84％，61％和36％。
　　在伴有上皮增生和化生的鼻息肉組織中Ki67的表達(dá)下降。免疫熒光染色結(jié)果顯示:在伴上皮增生的鼻息肉組織中Ki67+/p63+的比例明顯低于對照組（中位