MAT1蛋白切割與其調(diào)控的RARα低磷酸化抑制髓性白血病細胞惡性增殖的作用及其機制研究.pdf

1、本文對MAT1蛋白切割與其調(diào)控的RARα低磷酸化抑制髓性白血病細胞惡性增殖的作用及其機制進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：MAT1表達/切割對正常及惡性造血細胞增殖/分化的調(diào)控作用及其機制研究。
　　目的：髓性白血病是一類造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明且治療效果有待提高。參與調(diào)節(jié)細胞周期和基因轉(zhuǎn)錄的MAT1蛋白在正常造血干細胞的粒向分化過程中發(fā)生切割，但其在全反式維甲酸(ATRA)耐藥的髓性白

2、血病細胞中則以全長形式高表達，提示MAT1的表達和切割與正常及惡性造血細胞的增殖和分化密切相關(guān)，但其調(diào)控機制尚不明確。本部分研究將以MAT1、正常造血干細胞和髓性白血病細胞為研究對象，系統(tǒng)探討MAT1的表達和切割對正常及惡性造血細胞體內(nèi)外增殖和分化的影響，并闡明相關(guān)作用機制。
　　方法：本研究采用CD34+細胞（人源性造血干/祖細胞）、原代髓性白血病細胞和可傳代的髓性白血病細胞株作為研究對象。血球計數(shù)板結(jié)合臺盼藍染色法計數(shù)細胞數(shù)目

3、，從而計算細胞生存率、死亡率與倍增時間；采用分子克隆手段構(gòu)建全長MAT1和其切割片段pM9質(zhì)粒，并產(chǎn)出使細胞過表達MAT1和pM9的慢病毒；Western Blotting法檢測蛋白的表達和磷酸化水平；流式細胞術(shù)檢測細胞膜表面特異性抗原CD11b、CD66、CD34和CD19的表達量，或在動物模型中檢測表達GFP熒光蛋白的細胞比例；qRT-PCR法檢測MAT1、CD11b、CD66等mRNA轉(zhuǎn)錄水平；瑞姬染色檢測細胞核形態(tài)的改變；免疫熒

4、光法檢測MAT1和p21Cip/Kip蛋白在CD34+細胞中的表達量；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測MAT1切割片段的氨基酸序列，以推測MAT1的切割位點；免疫沉淀檢測多種蛋白之間的結(jié)合水平；HE染色和免疫組化染色檢測組織切片中特定蛋白的表達和腫瘤細胞的形態(tài)。
　　結(jié)果：(1)MAT1促進CD34+細胞擴增并抑制其粒向分化。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在CD34+細胞中過表達MAT1后，發(fā)現(xiàn)MAT1的過表達不僅可拮抗內(nèi)源性MAT1的切割降解，并且促

5、進了CD34+細胞的體外擴增。與此同時，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MAT1抑制細胞表達成熟粒細胞表面標(biāo)記物CD66和CD11b，瑞姬染色也證實MAT1過表達可抑制細胞核在ATRA誘導(dǎo)下出現(xiàn)粒細胞特異性的分葉狀形變，提示 CD34+細胞的體外擴增和粒向分化受MAT1表達的調(diào)控。為進一步明確MAT1在體內(nèi)對CD34+細胞的影響，將人源性間充質(zhì)干細胞與CD34+細胞共接種于免疫缺陷的NSG小鼠，從而構(gòu)建適宜CD34+細胞在體分化的微環(huán)境。通過流式細胞

6、分選結(jié)合qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)MAT1的過表達不僅促進CD34+細胞在骨髓內(nèi)的歸巢和在外周血中的擴增，而且抑制了細胞中CD11b和CD66的轉(zhuǎn)錄與表達，揭示MAT1在體內(nèi)也具有促進CD34+細胞擴增并維持其干細胞特性的作用。由于上述過程伴隨著細胞周期抑制蛋白p21Cip/Kip表達量的降低，提示MAT1可能通過下調(diào)p21Cip/Kip的表達促進造血干細胞擴增并且抑制其粒向分化。
　　(2)MAT1的活性切割片段pM9通過調(diào)控CA

7、K和TFIIH活性抑制髓性白血病細胞的惡性演進。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析全長MAT1和其切割片段M30的氨基酸序列，對比發(fā)現(xiàn)MAT1在C末端發(fā)生切割，從而產(chǎn)生M30和pM9兩個片段。經(jīng)分子克隆技術(shù)構(gòu)建Flag標(biāo)記的pM9質(zhì)粒后，采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在HL60、HL60R和Jurl-MK1三株髓性白血病細胞中過表達pM9，發(fā)現(xiàn)pM9不僅可降低內(nèi)源性MAT1的表達，而且可與內(nèi)源性MAT1競爭性結(jié)合cyclin H和CDK7從而構(gòu)成ΔCAK。

8、由于pM9不具備結(jié)合TFIIH XPD和XPB所需的結(jié)構(gòu)域，ΔCAK無法與TFIIH核心結(jié)合從而構(gòu)成完整的TFIIH激酶，因此pM9形成的ΔCAK能顯著抑制內(nèi)源性CAK和TFIIH的形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，pM9可抑制原代AML細胞和髓性白血病細胞株的體外增殖并促進原代細胞的粒向分化。WesternBlotting結(jié)合qRT-PCR結(jié)果顯示，上述作用可能是通過降低CDK7的磷酸化從而抑制CAK對下游蛋白CDK1和RARα的磷酸化激活，并且

9、干預(yù)TFIIH介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。但pM9的上述抑制作用僅局限于髓性白血病細胞，而對正常造血干細胞的擴增無明顯影響，造成其敏感性差異的原因可能是 pM9對RNA PolⅡ磷酸化水平的調(diào)控，以上結(jié)果提示pM9具有良好的腫瘤靶向性。在NSG小鼠白血病移植瘤模型中，pM9可模擬ATRA介導(dǎo)的MAT1切割，抑制ATRA耐受的髓性白血病細胞在體內(nèi)的增殖與轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：MAT1的表達促進造血干細胞的擴增并抑制其粒向分化，而MAT1的活

10、性切割片段pM9可模擬MAT1的切割并形成ΔCAK，從而影響內(nèi)源性CAK和TFIIH的形成與活性，最終特異性地抑制髓性白血病細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。
　　第二部分：基于低磷酸化RARαS77抑制ATRA耐藥的t(8;21)AML細胞基因轉(zhuǎn)錄的抗白血病增殖作用機制研究。
　　目的：非APL的急性髓性白血病(AML)細胞中的CAK-RARα信號通路阻滯是患者對ATRA分化療法不敏感的原因之一。第一部分研究已經(jīng)證實了MAT1的活性切

11、割片段pM9可形成ΔCAK，從而減少內(nèi)源性CAK對RARα的磷酸化并抑制髓性白血病細胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移。在本部分研究中，將以ATRA耐藥的t(8;21)AML為研究對象，考察RARα的磷酸化水平對基因轉(zhuǎn)錄與細胞增殖的影響，進而探討RARα的磷酸化與白血病細胞耐受ATRA之間的相關(guān)性和分子機制，為設(shè)計基于干預(yù)RARα磷酸化的全新抗白血病藥物提供思路及潛在靶點。
　　方法：采用原代t(8;21)AML細胞和可傳代的t(8;21)AML

12、細胞株作為研究對象。采用分子克隆手段構(gòu)建Flag標(biāo)記的RARα和RARαS77A質(zhì)粒，并產(chǎn)出使細胞過表達RARα和RARαS77A的慢病毒；血球計數(shù)板結(jié)合臺盼藍染色法計數(shù)細胞數(shù)目，從而計算細胞生存率和死亡率；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡時的核小體片段；Western Blotting法檢測蛋白的表達和磷酸化水平；qRT-PCR法檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；流式細胞術(shù)檢測細胞周期和表達GFP熒光蛋白的細胞比例；免疫沉淀檢測多種蛋白之間的結(jié)

13、合水平；HE染色和免疫組化染色檢測組織切片中特定蛋白的表達和腫瘤細胞的形態(tài)；染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合qPCR分析特定蛋白對靶基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　結(jié)果：持續(xù)低磷酸化的RARαS77突變體RARαS77A在多種髓性白血病細胞中的過表達可促進多種與細胞分化和凋亡相關(guān)的RA靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制細胞的體外增殖并誘導(dǎo)ATRA耐受的t(8;21)AML細胞株發(fā)生凋亡，而合用ATRA可進一步增強RARαS77A誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。在去除培養(yǎng)體系中的維

14、甲酸或給予靶向RARα配體結(jié)合域的RARα抑制劑Ro41-5253后，發(fā)現(xiàn)RARαS77A引起的細胞增殖抑制和促RA靶基因轉(zhuǎn)錄的作用未受影響。以上結(jié)果在原代t(8;21)AML細胞中也得到證實，提示RARαS77A的作用不依賴于配體作用以及RARα配體結(jié)合域的激活。將過表達RARαS77A的t(8;21)AML細胞株SKNO-1接種于免疫缺陷的NSG小鼠中，或同時給予ATRA后，采用流式細胞術(shù)檢測骨髓和外周血中SKNO-1細胞的比例，發(fā)

15、現(xiàn)與空白載體組相比，RARαS77A單獨或與ATRA合用均能顯著抑制SKNO-1細胞在骨髓和外周血中的增殖，并且抑制細胞向淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。為進一步闡明低磷酸化的RARαS77是如何調(diào)控RA靶基因轉(zhuǎn)錄從而抑制 t(8;21)AML細胞增殖，采用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測RARαS77A、RARα、RNA PolⅡ和ETO等蛋白與RA靶基因RARE區(qū)域的結(jié)合。結(jié)果顯示，RARβ2等RA靶基因的轉(zhuǎn)錄激活伴隨著RARαS77A與靶基因RARE區(qū)域結(jié)