GPR48通過HB-EGF反式激活EGFR誘導(dǎo)上皮細胞增殖和遷移的分子機制研究.pdf

1、目的:本課題組在之前的研究中已經(jīng)證明GPR48通過EGFR信號通路來調(diào)節(jié)眼瞼上皮細胞的增殖和遷移,進而調(diào)控小鼠的眼瞼發(fā)育,但其具體分子機制尚不清楚。本實驗將在之前研究的基礎(chǔ)上,對GPR48通過EGFR通路調(diào)控上皮細胞增殖和遷移的分子機制進行深入研究,進一步探討GPR48調(diào)控眼瞼發(fā)育的分子機制。
　　 方法:①在體外培養(yǎng)的Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠原代上皮細胞中加入EGFR的特異性酪氨酸激酶抑制劑AG1478后,用We

2、stern blot檢測EGFR的磷酸化程度及其下游信號通路分子的活化情況；
　　 ②使用免疫共沉淀法富集Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠原代上皮細胞條件培養(yǎng)基中EGFR的配體分子,Western blot檢測這些配體的蛋白表達情況；
　　 ③采用免疫沉淀的方法分別剔除Gpr48+/+與Gpr48-/-小鼠原代上皮細胞條件培養(yǎng)基中EGFR配體,并用該培養(yǎng)基培養(yǎng)Gpr48-/-細胞,應(yīng)用Western blot檢測E

3、GFR及其下游信號分子的磷酸化水平；
　　 ④加入外源性HB-EGF或其抑制劑CRM197作用細胞,應(yīng)用Western blot檢測EGFR的磷酸化及其下游信號通路分子的活化狀態(tài)；
　　 ⑤同時用體外BrdU和體外細胞劃痕兩種功能實驗檢測上皮細胞的增殖與遷移能力以驗證以上實驗結(jié)果。
　　 結(jié)果:(1)加入AG1478抑制劑作用Gpr48+/+與Gpr48-/-原代上皮細胞20min后,發(fā)現(xiàn)Gpr48+/+小鼠原代

4、上皮細胞中P-EGFR水平明顯下降。與此同時,細胞功能實驗中,檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)AG1478處理后,Gpr48+/+原代上皮細胞的增殖和遷移能力也受到了明顯的抑制；
　　 (2)Western blot檢測顯示ERK、STAT3磷酸化水平在Gpr48-/-原代上皮細胞中明顯低于Gpr48+/+原代上皮細胞,當加入AG1478作用后,Gpr48+/+與Gpr48+/+細胞的ERK、STAT3磷酸化水平都被抑制,Gpr48+/+原代上皮細胞

5、的抑制程度更強；
　　 (3)Western blot檢測Gpr48+/+和Gpr48-/-原代上皮細胞條件培養(yǎng)基中EGFR配體的蛋白表達,發(fā)現(xiàn)HB-EGF在Gpr48-/-小鼠原代上皮細胞培養(yǎng)基中的量明顯低于在Gpr48+/+小鼠原代上皮細胞中的量,而EGF、TGF-α二者的蛋白表達沒有差別；
　　 (4)免疫沉淀法分別剔除野生型和基因敲出型條件培養(yǎng)基中的EGF、TGF-α后刺激Gpr48-/-上皮細胞10min,野生

6、型上皮細胞的條件培養(yǎng)基可以激活Gpr48-/-上皮細胞中EGFR及其下游信號分子的活化；而剔除了Gpr48+/+原代上皮細胞條件培養(yǎng)基中的HB-EGF后,則不能激活Gpr48-/-上皮細胞中的EGFR及其下游信號分子的活化；
　　 (5)加入外源性HB-EGF刺激Gpr48-/-原代上皮細胞后,發(fā)現(xiàn)Gpr48-/-中P-EGFR、P-ERK、P-STAT3水平明顯升高；而用CRM197處理Gpr48+/+原代上皮細胞后,P-EG

7、FR、P-ERK、P-STAT3水平明顯下調(diào)；
　　 (6)細胞功能實驗研究發(fā)現(xiàn),HB-EGF作用Gpr48-/-原代上皮細胞前,Gpr48-/-細胞的增殖和遷移能力低于Gpr48+/+原代上皮細胞；用HB-EGF作用Gpr48-/-原代上皮細胞后,其增殖能力明顯增加,但遷移能力未得到明顯提高。
　　 結(jié)論:在眼瞼的發(fā)育中,GPR48通過HB-EGF反式激活EGFR信號通路,從而活化下游的ERK、STAT3等信號分子,進