利用轉(zhuǎn)座子插入突變篩選高效產(chǎn)油菌株.pdf

1、在能源危機(jī)日益嚴(yán)重的情況下，利用微生物油脂為原料制備生物柴油在未來(lái)生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)中將發(fā)揮重要作用，因此獲得高產(chǎn)油脂菌株具有重要意義。本文以發(fā)酵性絲孢酵母（Trichosporon rmentans）2．1368為出發(fā)菌株，利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)將mTn3轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入到出發(fā)菌株的亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中進(jìn)行隨機(jī)突變，從中篩選高產(chǎn)油脂酵母，為進(jìn)一步研究和分析插入位點(diǎn)基因奠定基礎(chǔ)。 根據(jù)mTn3轉(zhuǎn)座標(biāo)簽的性質(zhì)，首先利用亞硝基胍誘變篩選出發(fā)酵性絲

2、孢酵2．1368的亮氨酸缺陷型（2．1368-Leu-），這是利用mTn-LacZ/Lzu2轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽文庫(kù)質(zhì)粒對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行插入突變的前提；又通過(guò)紫外誘變處理2．1368的亮氨酸缺陷型菌株（2．1368-Leu-），篩選尿嘧啶缺陷型，期望獲得雙缺陷型菌株，為后期試驗(yàn)中用質(zhì)粒拯救法鑒定轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。 用mTn3轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入文庫(kù)質(zhì)粒對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母2．1368進(jìn)行插入突變，最終得到了166個(gè)轉(zhuǎn)化子。試驗(yàn)中用15個(gè)轉(zhuǎn)座子

3、標(biāo)簽文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化酵母，只有11個(gè)質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物能夠成功轉(zhuǎn)化。利用LacZ顯色反應(yīng)，根據(jù)其顯色水平，對(duì)同源重組載體進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)能夠成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)庵標(biāo)簽文庫(kù)質(zhì)粒中，有9個(gè)能夠和出發(fā)菌株進(jìn)行同源重組，為下一步試驗(yàn)提供了依據(jù)：同時(shí)得到了139株同源重組子，可以從中篩選目的菌株。 利用脂肪酸合成酶抑制劑淺藍(lán)菌素（Cerulenin）和磷酸香草醛反應(yīng)篩選高產(chǎn)油脂酵母菌，并對(duì)初篩菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)篩，最終得到兩株在玉米秸稈糖化液