釀酒酵母泛素化酶與去泛素化酶基因敲除及泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、真核細胞中蛋白質(zhì)特異性降解主要由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)完成。在這一途徑中,泛素首先被泛素活化酶(E1)激活,然后被轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶(E2)上;泛素連接酶(E3)識別底物和E2,并將泛素從E2上轉(zhuǎn)移到目的蛋白上;目的蛋白被泛素共價修飾,進而被26S蛋白酶體識別并降解;底物上的泛素鏈則被去泛素化酶(DUB)解離并循環(huán)使用。已有研究報道E2,E3,DUB的功能和作用機制,但很少有系

2、統(tǒng)性研究它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的報道。
　　本文利用PCR技術(shù)擴增卡那霉素抗性基因,并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,通過同源重組,分別敲除E2,E3和DUB基因。之后用G418抗性平板篩選和PCR驗證,獲得E2,E3,DUB基因單敲除菌種。泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是廣泛存在于E2,E3,DUB中的結(jié)構(gòu)域,用于識別并結(jié)合泛素。本文人工合成了泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因Q2,通過分子克隆技術(shù)插入pGEX(kt)載體,構(gòu)建原

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