人泛素活化酶UBE1DC1、UBE1及人泛素結(jié)合酶UBE2F的功能研究.pdf

1、泛素UB或類泛素分子UBLs作為一種蛋白修飾分子在泛素結(jié)合途徑的第一步起作用。此途徑參與體內(nèi)許多重要的生理功能,包括細(xì)胞周期的調(diào)控、抗原遞呈、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡、DNA損傷和修復(fù)等。泛素與蛋自底物的結(jié)合則是泛素化途徑必需的過程,它經(jīng)由三步級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行下去,泛素活化酶作為在泛素化途徑第一步起重要作用的蛋白,它能活化泛素或者類泛素分子。泛素活化酶E1在需要ATP的反應(yīng)中激活泛素UB或者類泛素分子產(chǎn)生一個(gè)高能硫羥酸酯媒介,E1-S～泛素。泛索

2、結(jié)合酶E2結(jié)合活化的泛素或者類泛素分子,并將激活的泛素部分轉(zhuǎn)移到泛素連接酶E3或底物。本文對泛素活化酶UBElDC1、UBE1及泛素結(jié)合酶UBE2F的功能進(jìn)行了初步探討。
　　 人泛素活化酶UBE1DC1A(ubiquitin-activating enzyme E1-domaincontaining 1)及其新的剪接體UBE1DC1B被認(rèn)為是類泛素活化酶家族成員。UBE1DC1與人泛素活化酶UBEI的相應(yīng)區(qū)域具有高度同源性,且

3、兩者都具有保守的ThiF結(jié)構(gòu)域,含有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GXGXXG)。通過大腸桿菌表達(dá)獲得了UBE1DC1A、UBE1DC1B、UB以及多種類泛素分子UBLs蛋白,經(jīng)體外免疫印記檢測UBE1DC1活化泛素及類泛素分子的特異性發(fā)現(xiàn),它除了能活化類泛素分子Ufm1外還能活化類泛素分子SUM02,這得到了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。通過Blast程序同源性比較發(fā)現(xiàn)Ufm1和SUM02蛋白無同源性,說明UBE1DC1可能不像其他類泛素活化酶只能激活一種

4、類泛素分子,它能同時(shí)活化兩種不同類型的類泛素分子。同源比較和突變試驗(yàn)確定了Cys250是其活性位點(diǎn)。UBE1DC1和SUM02在AD293細(xì)胞內(nèi)的定位試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)UBE1DC1與SUM02共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,UBE1DC1的細(xì)胞定位從細(xì)胞質(zhì)定位變成了細(xì)胞核定位,推測UBE1DC1可能在細(xì)胞質(zhì)中激活SUM02之后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,進(jìn)而參與E2反應(yīng)。
　　 UBE1是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的泛素活化酶,它在泛素化途徑的第一步活化泛素上起重要作用。制

5、備獲得高純度的UBE1是研究其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與生化性質(zhì)以及用于泛素化途徑下游相關(guān)酶活性測定的基礎(chǔ)。在全基因合成的基礎(chǔ)上,全長UBE1基因成功地在大腸桿菌中獲得了高表達(dá),根據(jù)表達(dá)載體所攜帶的6His標(biāo)簽以及UBE1能活化UB形成UB-UBE1復(fù)合物的特性,經(jīng)Ni-NTA柱層析和Strep-Tactin Sepharose柱層析,純化得到了高純度的UBE1蛋白,純化得到的UBE1蛋白經(jīng)活性分析發(fā)現(xiàn)具有泛素活化酶活性。通過對UBE1、UB以及UB

6、-UBE1復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)測定發(fā)現(xiàn),UBE1與UB反應(yīng)形成UB-UBE1交聯(lián)復(fù)合物后,它的二級構(gòu)象與單一的UBE1二級構(gòu)象相比發(fā)生了顯著變化,說明了UB與UBE1交聯(lián)后引起了UBE1結(jié)構(gòu)較大的變化,特別是α螺旋的含量明顯增加。
　　 泛素結(jié)合酶則在泛素修飾途徑的第二步反應(yīng)過程中起重要作用。通過篩選cDNA文庫,我們從人胎腦文庫中克隆到了一種新的人泛素結(jié)合酶ubiquitin-conjugating enzyme E2F,將它命名

7、為UBE2F。UBE2F基因cDNA序列全長1366bp,編碼一個(gè)185aa蛋白。它與大部分的人泛素結(jié)合酶一樣,具有同源性較高的保守結(jié)構(gòu)域UBCc,且都含有半胱氨酸活性位點(diǎn)、UB硫脂鍵互作位點(diǎn)及E3互作位點(diǎn)。UBE2F與生物體中同源蛋白是高度保守的,且UBE2F基因在絕大多數(shù)人體組織中都有表達(dá),因而我們推測UBE2F應(yīng)該是具有泛素活化酶活性。
　　 在此研究中,我們發(fā)現(xiàn)UBE2F能結(jié)合被UBE1泛素化的UB,產(chǎn)生UB-UBE2F