水稻E3泛素連接酶編碼基因DSG1的功能分析.pdf

1、株高和粒形是水稻最重要的農(nóng)藝性狀，其調(diào)控機(jī)理的研究一直被認(rèn)為是將來(lái)提高水稻產(chǎn)量的重要手段。我們?cè)贓MS突變體庫(kù)中篩選到了一個(gè)穩(wěn)定遺傳的突變體，該突變體同時(shí)影響株高和粒形的發(fā)育，其株高顯著降低、籽粒明顯變短，因此將其命名為水稻矮化短粒突變體dwarf and short grain1（dsg1）。遺傳分析確定dsg1突變性狀是受一對(duì)隱性核基因控制。DSG1被定位在第3染色體70Kb范圍內(nèi)，該區(qū)間已有一個(gè)與dsg1表型類(lèi)似的突變體報(bào)道。通過(guò)

2、測(cè)序獲得一個(gè)編碼U-box結(jié)構(gòu)域的候選基因，并參與水稻株高和粒型的調(diào)控。在本研究中，我們將通過(guò)表型鑒定、基因定位和候選基因驗(yàn)證等方法確定目的基因，最后通過(guò)表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位、超表達(dá)分析、細(xì)胞學(xué)分析以及激素實(shí)驗(yàn)等分析DSG1控制水稻株高及粒形的相關(guān)機(jī)理，為進(jìn)一步開(kāi)展基因互作等研究奠定基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下：
　　1、形態(tài)學(xué)及農(nóng)藝性狀分析：與野生型相比，在苗期，dsg1突變體的根長(zhǎng)和幼苗高度顯著減小，dsg1突變體葉鞘長(zhǎng)度降低；在生

3、殖生長(zhǎng)階段，dsg1突變體株高顯著降低，且所有節(jié)間長(zhǎng)度變短；dsg1突變體籽粒長(zhǎng)度減小、結(jié)實(shí)率降低；dsg1突變體小穗長(zhǎng)度減少，平均單位面積細(xì)胞數(shù)顯著增加，小穗的平均細(xì)胞長(zhǎng)度降低；dsg1突變體的劍葉、倒二和倒三葉寬度增加，且倒三葉長(zhǎng)度縮短，dsg1突變體葉片的下部嚴(yán)重卷曲。
　　2、遺傳分析及基因定位：利用不育系西農(nóng)1A與dsg1突變體雜交，所有F1植株顯示正常表型，F(xiàn)2植物呈3：1（正常：矮化）的分離比，表明dsg1突變體表型

4、由單個(gè)隱性核基因控制。通過(guò)基因定位，DSG1基因被定位在第3染色體上的標(biāo)記SSR3-28和 RM14645之間的190kb DNA區(qū)域；測(cè)序分析鑒定突變基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os03g13010。
　　3、DSG1的候選基因驗(yàn)證：通過(guò)構(gòu)建LOC_Os03g13010野生型DNA片段載體，轉(zhuǎn)化 dsg1突變體。陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的突變表型得到了完全的恢復(fù)。因此確定LOC_Os03g13010就是DSG1的目的基因。
　　4、DSG1的表達(dá)

5、模式分析：通過(guò)qRT-PCR和ProDSG1::GUS在不同組織中檢測(cè)到DSG1表達(dá)。DSG1在根、莖、葉片、葉鞘和小穗中表達(dá)較好。其中，DSG1在葉和小穗中的表達(dá)水平高于其它組織。
　　5、亞細(xì)胞定位：將DSG1的編碼序列融合至GFP的N末端，去掉終止密碼子，并在35S啟動(dòng)子控制下的水稻原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。DSG1蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　6、超表達(dá)研究：通過(guò)構(gòu)建超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化中花11。DSG1表達(dá)量在超表

6、達(dá)植物中顯著增加。與野生型相比，超表達(dá)植株在植物高度或籽粒長(zhǎng)度方面均沒(méi)有顯著差異。
　　7、細(xì)胞學(xué)分析：通過(guò)體式鏡、石蠟切片，掃描電鏡等分析，確定dsg1突變體中的突變表型是由于在不同組織中細(xì)胞分裂或細(xì)胞伸長(zhǎng)缺陷造成的。同時(shí) DSG1還參與了葉片側(cè)向發(fā)育。
　　8、激素途徑分析：dsg1突變體表現(xiàn)出典型的油菜素內(nèi)酯（BR）缺失表型，矮化和緊湊的株形，寬和直立的葉子，并且分蘗減少。葉夾角傾斜實(shí)驗(yàn)表明 DSG1參與BR反應(yīng)，屬于

7、 BR不敏感突變體。同時(shí) BR途徑相關(guān)基因，OsD1、OsGSK1、OsMADS55和BZR1在dsg1成熟葉片中比在野生型中表達(dá)量下調(diào)。此外，通過(guò)qRT-PCR分析DSG1在用各種外源激素（包括BR、GA、IAA、ETH、SA和ABA）處理植株中的表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明，DSG1被BR、ETH、IAA和SA抑制。這些結(jié)果說(shuō)明DSG1參與了多種激素途徑。
　　9、E3泛素連接酶活性測(cè)定：DSG1編碼U-box結(jié)構(gòu)域，E3連接酶活