鈣離子結(jié)合蛋白基因GhCaM7和GhAnn2在棉花纖維伸長中的功能分析.pdf

1、棉花纖維的伸長決定著纖維的質(zhì)量和產(chǎn)量。對棉花伸長相關(guān)基因的發(fā)掘和及其分子機理的研究具有重要意義。雖然利用表達譜和其他功能基因組手段找到一些對棉花纖維發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，但是這些基因在纖維發(fā)育中的作用機理還很不清楚。在本實驗室涂禮莉老師構(gòu)建的海島棉全生育期纖維cDNA文庫中，我們找到兩個在纖維伸長時期高豐度表達的鈣離子結(jié)合蛋白基因GhCaM7（陸地棉鈣調(diào)素7）和GhAnn2（陸地棉膜聯(lián)蛋白2），并通過轉(zhuǎn)基因、細胞生物學(xué)、藥理學(xué)和電生理學(xué)等

2、手段對這兩個基因在纖維發(fā)育中的功能做了一定的闡述。具體結(jié)果如下:
　　1、GhCaM7(TC232366)在發(fā)育中的纖維中高量表達，且其表達豐度在所有鈣調(diào)素成員中最高。
　　通過搜索DFCI棉花EST數(shù)據(jù)庫中找到7個陸地棉鈣調(diào)素家族成員基因。RT-PCR的結(jié)果顯示有三個成員TC232366、TC244650和TC256165在纖維中有較高量的表達。進一步通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)TC232366(GhCaM7)在纖維中的表達豐度

3、較另外兩個鈣調(diào)素更高。GhCaM7在纖維發(fā)育中的表達跟纖維頂端鈣離子流入速度趨勢一致，并且這個基因在無纖維突變體胚珠中表達較正常陸地棉品系低，這些結(jié)果說明，GhCaM7可能在纖維發(fā)育中起著重要作用。
　　2、GhCaM7對早期纖維的發(fā)育有促進作用。
　　將GhCaM7在35S啟動子驅(qū)動下進行超量表達和RNA特異干涉。表型鑒定結(jié)果顯示，超量表達GhCaM7能夠促進纖維早期的伸長而不是后期，而抑制GhCaM7的表達會使纖維的突起

4、延遲且纖維的伸長也會受到抑制。另外，體外胚珠培養(yǎng)實驗結(jié)果也同樣顯示，胚珠在BT培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后，GhCaM7超量表達的纖維明顯長于野生型，而干涉纖維明顯短于野生型。用鈣調(diào)素的拮抗劑TFP（三氟拉嗪）處理培養(yǎng)中的胚珠，纖維發(fā)育也明顯受到抑制。這些結(jié)果都說明GhCaM7對早期纖維發(fā)育有促進作用。
　　3、GhCaM7能通過調(diào)控ROS的產(chǎn)生來促進纖維早期發(fā)育。
　　通過外源添加雙氧水和鈣饑餓誘導(dǎo)實驗，發(fā)現(xiàn)一定量的活性氧在纖維伸

5、長中都能起到正調(diào)控的作用。我們通過活性氧定性和雙氧水定量實驗檢測了GhCaM7轉(zhuǎn)基因材料纖維和胚珠中的ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhCaM7超表達促進了ROS的積累，而GhCaM7干涉材料中ROS水平明顯比野生型低。同時利用胚珠培養(yǎng)體系對轉(zhuǎn)基因和野生型胚珠進行了雙氧水和DPI（活性氧抑制劑）的處理，結(jié)果也表明GhCaM7可能在ROS的上游行使功能。
　　4、ROS對GhCaM7的表達也有調(diào)控作用。
　　通過非損傷微測技術(shù)和胚珠培

6、養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)雙氧水能促進鈣離子的內(nèi)流和鈣庫鈣離子的釋放。qRT-PCR結(jié)果顯示外源雙氧水也能誘導(dǎo)GhCaM7的表達，這說明ROS可以引發(fā)鈣離子的內(nèi)流來增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，這樣就進一步激活GhCaM7的表達。另外，鈣庫鈣離子釋放通道抑制劑的處理實驗也顯示鈣饑餓的條件下，ROS的水平受到誘導(dǎo)上升，從而促進內(nèi)源鈣庫的鈣離子的釋放，進而上調(diào)GhCaM7的表達，進一步證明ROS可以調(diào)節(jié)GhCaM7的表達。
　　5、GhCaM7在IAA誘導(dǎo)的

7、纖維伸長中起著積極作用。
　　qRT-PCR分析結(jié)果表明GhCaM7可以被IAA誘導(dǎo)表達。隨后利用胚珠培養(yǎng)體系進一步考察GhCaM7和IAA的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BT培養(yǎng)基中不加IAA或加入NPA（IAA運輸抑制劑）時，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系纖維長度沒有顯著差別。而當(dāng)BT培養(yǎng)基中加入TFP之后，IAA促進纖維伸長的效果被明顯削弱。由此看來，GhCaM7在IAA誘導(dǎo)的纖維伸長中起著積極的作用。而GhCaM7只有在IAA存在的條件下才

8、能更好的在纖維發(fā)育中行使作用。
　　6、GhCaM7與IAA協(xié)同調(diào)控ROS產(chǎn)生
　　5μMIAA處理胚珠能顯著促進纖維伸長，也能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。而ROS抑制劑能顯著減弱IAA對纖維伸長的促進效果。這說明IAA可能在一定程度上通過ROS來影響纖維伸長。胚珠ROS熒光染色結(jié)果顯示，TFP可以明顯減弱IAA誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生。同時在IAA存在條件下，GhCaM7水平越高ROS產(chǎn)生越多，而在IAA少量存在或沒有的條件下，GhCaM

9、7不能更好的促進ROS的產(chǎn)生。而減弱鈣調(diào)素作用，IAA同樣也不能很好的產(chǎn)生ROS。這說明GhCaM7和IAA協(xié)同調(diào)控ROS的產(chǎn)生。
　　7、GhAnn2在發(fā)育中的纖維中高量表達，并在纖維伸長期有表達高峰。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GhAnn2可能來自D基因組。將D基因組所有的膜聯(lián)蛋白基因找出來并對他們進行RT-PCR和qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7個膜聯(lián)蛋白基因家族成員在纖維中有表達，其中GhAnn2在纖維快速伸長期有表達高

10、峰。
　　8、GhAnn2下調(diào)表達抑制纖維伸長和細胞壁的合成
　　對GhAnn2干涉株系進行纖維長度和細胞壁厚度的考查結(jié)果顯示GhAnn2干涉株系各個發(fā)育時期纖維較野生型顯著變短且成熟纖維細胞壁顯著變薄。qRT-PCR分析表明一些纖維伸長和次生壁合成相關(guān)基因在干涉纖維中表達下調(diào)。這說明GhAnn2是纖維正常發(fā)育所必需的。
　　9、GhAnn2干涉纖維頂端鈣離子流入減弱
　　非損傷微測技術(shù)測定纖維頂端鈣離子流發(fā)現(xiàn)，

11、GhAnn2被干涉后，纖維頂端的鈣離子流呈外流狀態(tài)，而野生型纖維頂端鈣離子呈正常的內(nèi)流狀態(tài)。這說明GhAnn2干涉后纖維頂端的鈣離子內(nèi)流減弱。另外用鈣離子通道抑制劑La3+處理離體培養(yǎng)的胚珠發(fā)現(xiàn)GhAnn2干涉的纖維對La3+更加敏感。由此推測，GhAnn2的表達下調(diào)使得纖維頂端鈣離子內(nèi)流減弱導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度變小，從而對鈣離子通道抑制劑更加敏感。
　　10、GhAnn2的抑制表達擾亂纖維細胞中鈣離子信號的傳遞
　　由于G