棉花絨毛蛋白基因的功能研究.pdf

1、棉花纖維是由胚珠部分表皮細(xì)胞分化，經(jīng)歷起始、伸長(zhǎng)、次生加厚和成熟四個(gè)完全不同但又部分重疊的發(fā)育階段發(fā)育成的單細(xì)胞纖維，在此過(guò)程中，纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)了1000～3000倍。微絲骨架的動(dòng)態(tài)變化為細(xì)胞的快速軸向擴(kuò)張?zhí)峁?dǎo)向和網(wǎng)絡(luò)支撐，運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和進(jìn)行信號(hào)傳遞。因此，微絲骨架是棉花纖維發(fā)育的重要影響因素之一?？梢耘c微絲結(jié)合的蛋白(ABP)多達(dá)160多種，它們可以與微絲單體、多聚體結(jié)合，參與微絲的聚合、解聚、穩(wěn)定性、排序、捆綁、網(wǎng)絡(luò)化、碎片化、解體

2、，調(diào)控微絲骨架，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性。植物的肌動(dòng)蛋白解聚因子(ADF)、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(Profilin)、絲束蛋白(Fimbrin)等ABP對(duì)微絲骨架的調(diào)控作用有不少報(bào)道，近年來(lái)，在擬南芥、水稻、煙草中發(fā)現(xiàn)絨毛蛋白(villin)基因?qū)τ诩?xì)胞伸長(zhǎng)和形態(tài)形成、非生物脅迫等起調(diào)控作用。但是尚無(wú)棉花villin基因的報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)室曾以纖維伸長(zhǎng)受阻的突變體Li-1（李氏無(wú)纖維）和其野生型的近等基因系TM-1為材料，分析

3、了開(kāi)花后4d、8 d(DPA)纖維的蛋白質(zhì)組差異，鑒定了一個(gè)在Li-1纖維中下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)。編碼該蛋白質(zhì)的基因被克隆并被命名為GhVLN。將該基因轉(zhuǎn)入裂殖酵母使得酵母顯著增長(zhǎng)，長(zhǎng)寬比顯著變大。因此，推測(cè)蛋白質(zhì)可能與細(xì)胞伸長(zhǎng)有關(guān)，對(duì)于棉花纖維的伸長(zhǎng)起調(diào)控作用。為了驗(yàn)證GhVLN對(duì)于細(xì)胞骨架和棉纖維發(fā)育的影響，本文開(kāi)展以下研究:
　　1、將棉花GhVLN基因ORF全長(zhǎng)構(gòu)建到35S-pBI121表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌浸花法將它們導(dǎo)入擬南芥

4、。經(jīng)過(guò)卡那霉素(Kan+)抗性篩選及PCR檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)GhVLN基因擬南芥5株陽(yáng)性植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的觀察發(fā)現(xiàn)，相比于野生型擬南芥，GhVLN過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根長(zhǎng)增長(zhǎng)，側(cè)根增多，根毛變多、變長(zhǎng)。GhVLN對(duì)擬南芥根系和根毛的發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用。150mM鹽脅迫處理下，GhVLN過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥根系伸長(zhǎng)受抑制的程度輕于野生型擬南芥，GhVLN可以提高植物的耐鹽性。
　　2、構(gòu)建了pBI121-GhVLN重組植物

5、過(guò)表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化棉花。觀察并記錄組織培養(yǎng)各個(gè)時(shí)期的特征，目前已經(jīng)誘導(dǎo)出胚性愈傷組織并初步獲得了轉(zhuǎn)基因棉花T0代陽(yáng)性再生植株幼苗，陽(yáng)性苗的嫁接正在進(jìn)行。為研究微絲骨架及該基因在棉花發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　3、將GhVLN基因全長(zhǎng)加上六聯(lián)組氨基酸標(biāo)簽克隆至pET30原核表達(dá)載體上，IPTG誘導(dǎo)下，Gh VLN大量表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)其分子量大約為110kDa，與理論分子量一致。通過(guò)優(yōu)化GhVLN基因