棉花CCCH型鋅指蛋白基因GhZFP1的分離、功能鑒定及其作用機制的研究.pdf

1、高鹽和真菌脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要影響因子。植物在長期的進化過程中形成了多種適應(yīng)機制，其中包括脅迫條件下一些基因被誘導表達，并通過直接或間接的方式調(diào)控下游靶基因的表達，從而在提高植物抗逆性中發(fā)揮重要作用。因此，研究在適應(yīng)脅迫過程中重要基因的表達調(diào)控及功能對了解植物在逆境條件下的響應(yīng)和適應(yīng)機制是十分必要的。鋅指蛋白是一類生物體中廣泛存在的具有典型鋅指結(jié)構(gòu)特征的超蛋白家族，幾乎參與了生物體生長發(fā)育的各個階段。根據(jù)鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)及功能特點

2、，鋅指蛋白主要分為九大類：C2H2，C8，C6，C3HC4，C2HC，C2HC5，C4，C4HC3，CCCH(C，H分別代表半胱氨酸和組氨酸)，一些與逆境相關(guān)的植物鋅指蛋白相繼被人們發(fā)現(xiàn)和研究。但迄今為止，與逆境脅迫相關(guān)的植物CCCH型鋅指蛋白尚未有報道。 本研究以世界上重要經(jīng)濟作物棉花為材料，構(gòu)建了鹽誘導棉花幼苗葉片cDNA文庫，并用反向Nortnhern差異篩選法獲得一個與鹽脅迫相關(guān)的棉花鋅指蛋白基因GhZFP1。進一步序列

3、比較及同源性分析表明，GhZFP1編碼了一個CCCH型鋅指蛋白，目前對該類型鋅指蛋白的研究相對較少。因此本論文通過對其序列、表達及生物學功能的研究，探索了GhZFP1與植物抗逆性之間的關(guān)系，并利用酵母雙雜交的方法，從棉花中篩選到9個與其相互作用的蛋白，從而進一步對其信號響應(yīng)及分子作用機制有了更深層次的了解。主要研究結(jié)果如下： 1、利用Clontech Smart<'TM> cDNA Library ConstructionKit

4、構(gòu)建鹽脅迫誘導棉花幼苗葉片cDNA3文庫，通過反向Northenrn差異篩選法獲得一個與鹽脅迫相關(guān)的鋅指蛋白基因GhZFP1 5’端。設(shè)計特異引物進行3’-RACE克隆到GhZFP1基因的3’端，拼接后用特異引物擴增到1017bp的GhZFP1全長cDNA，編碼一個339氨基酸的蛋白，推測其分子量為38.4kDa． 2、同源序列比較表明，GhZFP1編碼了一個CCCH型鋅指蛋白，屬于一個研究較少的CCCH型鋅指蛋白家族。氨基酸序

5、列分析表明GhZFP1有兩個比較典型的CCCH型鋅指(CX<,8>CX<,5>CX<,3>H，CX<,5>CX<,4>CX<,3>H)，在其N端和C端分別有一個核定位信號序列(NLS)和一個可能的核輸出信號序列(NES)，跨膜結(jié)構(gòu)分析表明在其190-213氨基酸之間存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，因此推測GhZFP1可能作為一種重要調(diào)控因子起作用。GhZFP1是棉花中首次被克隆的CCCH型鋅指蛋白基因，對其表達及功能探索將大大促進整個CCC

6、H型鋅指蛋白家族的研究。 3、Northern表達分析結(jié)果表明GhZFP1受NaC1、PEG和SA誘導表達，在一定時間范圍內(nèi)其表達水平隨誘導時間的延長而增加，但不受CuSO<,4>、ABA、4℃、CaCl<,2>和乙烯誘導，說明GhZFPl對鹽脅迫的非專一性，可以響應(yīng)多種生物與非生物脅迫。在NaCl處理下，GhZFP1在莖和葉中均有表達，以莖中最高，在根中沒有表達，并且在中棉所19號(ZMS19)中的表達量要顯著高于在中棉所17

7、號(ZMS17)中的表達，說明GhZFP1表達不僅具有一定的組織特異性而且與不同棉花品種的耐鹽性也有關(guān)。Southern雜交結(jié)果表明GhZFP1在棉花基因組中是以單拷貝的形式存在的。 4、聚類分析表明GhZFP1與擬南芥中一小類CCCH型鋅指蛋白在整個系統(tǒng)進化樹上形成獨特的一枝。序列分析表明該分枝的每個成員除了具有保守的兩個鋅指外，還有一些其它共同特征，在其第一個鋅指前都有一個由38個氨基酸組成的保守區(qū)，在其C端都有一個NES序

8、列，基因內(nèi)部都沒有內(nèi)含子。用SubLoc v1.0亞細胞定位分析軟件預測它們都定位于細胞核內(nèi)，但均未預測到可能的NLS序列。最近的擬南芥芯片研究和GhZFP1誘導表達分析也表明，該分枝成員的表達都受到不同生物和非生物脅迫誘導，因此命名其為與SRZFP亞家族(stress-related zinc finger protein subfamily)。本研究是在植物中首次發(fā)現(xiàn)與脅迫相關(guān)的CCCH型鋅指蛋白家族，可能也是高等植物特有的CCCH

9、型鋅指蛋白家族。 5、將GhZFP1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞內(nèi)瞬時表達，在洋蔥表皮細胞的細胞核內(nèi)觀察到綠色熒光，表明GhZFP1編碼了一個核定位蛋白。 6、在煙草中超表達GhZFP1基因，用GhZFP1特異探針標記的Northern雜交結(jié)果表明GhZFP1只在轉(zhuǎn)基因植株中表達。同野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草能在200mM，250mMNaC1條件下正常生長，生長勢、根長及鮮重都要明顯好于野生型。經(jīng)過200mM NaC1處理

10、后，轉(zhuǎn)基因植株Fv/Fm和k<'+>/Na<'+>比要明顯高于野生型植株，尤其是體內(nèi)積累的Na<'+>離子含量要小于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株地上部K<'+>/Na<'+>比要遠高于野生型植株。這些結(jié)果說明GhZFP1的過量表達能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽能力。用立枯菌(RhizoctoniasoIani)對煙草植株進行活體接菌實驗，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株較野生型抗病能力明顯增強。 7、從GhZFP1中選取N端大約185氨基酸的親水區(qū)域構(gòu)建

11、原核表達載體pET30a-GhZFP1-185，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達融合蛋白，將該融合蛋白進行純化獲得抗原，免疫家兔，其抗血清效價為1:1000。 8、用BD Matchmaker<'TM> Library Construction & Screening Kits構(gòu)建酵母雙雜交文庫，以GhZFP1 N端l-237氨基酸(m1)為誘餌蛋白對文庫進行篩選，獲得9個與其相互作用的靶蛋白。Northern雜交結(jié)果表明，

12、其中的一個靶蛋白基因GZIRD21A的表達受PEG和SA誘導，而另一個靶蛋白基因GZIPR5的表達受NaCl和SA誘導，它們的誘導表達模式與GhZFP1的表達模式十分相似，初步推測GZIRD21A和GZIPR5可能在響應(yīng)不同的生物和非生物脅迫中，與GhZFP1形成復雜的蛋白復合物，從而在不同的信號傳遞途徑中發(fā)揮著重要作用。 9、GhZFP1與GZIRD21A和GZIPR5的相互作用結(jié)構(gòu)域的鑒定實驗表明，GhZFPl與GZIRD2