棉花響應(yīng)黃萎病菌分子機制的蛋白質(zhì)組學研究及HDTF1基因的功能鑒定.pdf

1、棉花是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一。但是，棉花纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量受到棉花黃萎病的嚴重制約。棉花黃萎病是一種由大麗輪枝菌引起的土傳性真菌維管束病害。當黃萎病暴發(fā)時，棉花的纖維品質(zhì)和產(chǎn)量都會受到非常嚴重的影響，甚至會達到30％以上的減產(chǎn)。因此棉花黃萎病又被稱為‘棉花的癌癥’。然而目前在世界范圍內(nèi)都沒有發(fā)現(xiàn)比較好的陸地棉抗黃萎病種質(zhì)資源。遺傳資源的缺乏，對發(fā)掘優(yōu)良的抗病基因形成了挑戰(zhàn)。另一方面，棉花黃萎病菌生理小種多，小種變異性強，加大了對棉花抗

2、黃萎病菌的抗病機制以及抗病育種研究的難度。海島棉相對于陸地棉品種往往表現(xiàn)出較好的耐病甚至抗病性，因此在海島棉的抗病品種中，可能存在某些抗病基因或抗性機制。我們選擇海島棉品種海‘7124’作為研究材料，通過比較蛋白質(zhì)組學的方法，來發(fā)掘棉花中的抗病相關(guān)基因，并研究其可能存在的抗病機制。
　　通過雙向電泳分析以及質(zhì)譜鑒定，一共得到了188個在海‘7124’根系中受黃萎病菌侵染后與水處理的平行對照相比表達量出現(xiàn)差異的蛋白。在這些差異表達的

3、蛋白中，下調(diào)表達的蛋白數(shù)量達到47％，接近差異表達蛋白總數(shù)量的一半。通過生物學功能注釋分類，這些差異蛋白一共可以分為17類。其中參與細胞過程、代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)的蛋白數(shù)量最多。這些蛋白共同參與了棉花對黃萎病菌入侵的響應(yīng)。說明棉花在受病原菌侵染后，正常情況下的細胞過程和生理代謝都發(fā)生了變化。
　　棉酚是棉花特有的一類次生代謝物。在我們的蛋白表達譜中發(fā)現(xiàn)兩個與棉酚代謝相關(guān)的酶GbCAD1和GbdHG-6-OMT。GbCAD1基因編碼杜

4、松稀合成酶，是棉酚合成的限速酶。通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)干涉GbCAD1后，發(fā)現(xiàn)GbCAD1干涉植株棉酚含量顯著降低。接種強致病力落葉型黃萎病菌‘V991’后發(fā)現(xiàn)，干涉植株對黃萎病的抗性明顯降低。說明棉酚可能影響棉花對黃萎病菌的抗性。在棉花根系中，檢測黃萎病侵染后其它一些棉酚代謝相關(guān)基因的表達發(fā)現(xiàn)，棉酚合成在棉花受黃萎病侵染后是被激活的。而作為棉酚活性的負調(diào)控因子，編碼脫氧半棉酚-6-氧甲基轉(zhuǎn)移酶的GbdHG-6-OMT基

5、因在病原菌侵染后下調(diào)表達。通過組織切片、組織化學染色以及棉酚含量的測定，進一步確認了棉花在黃萎病菌侵染后，植株體內(nèi)的棉酚含量是大量積累的。這些結(jié)果表明棉酚的積累可能參與抵抗黃萎病菌的侵染。在研究棉酚代謝上游的調(diào)控因子及調(diào)控方式時，通過檢測抗病相關(guān)植物激素水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理后，棉酚代謝相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)JA處理后，棉花植株體內(nèi)棉酚代謝相關(guān)基因GbFPS、GbCAD1和WRKY1表達上調(diào)。這說明棉酚代謝可能受茉莉酸

6、信號的調(diào)控。
　　BR介導(dǎo)的信號路徑除了在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能外，也參與了植物抗病。我們分離到兩個在V991侵染后蛋白水平下調(diào)的14-3-3蛋白Gb14-3-3c和Gb14-3-3d。14-3-3蛋白是BR信號路徑的負調(diào)控因子，通過調(diào)控BZR1和BZR2的蛋白定位，來影響B(tài)ZR1和BZR2的活性，進而影響B(tài)R信號的傳遞以及下游基因的表達。而RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在棉花受黃萎病侵染后，與BR信號路徑正相關(guān)的關(guān)鍵基因GbB

7、RI1和GbBZR1的表達量上調(diào)。說明黃萎病菌侵染后棉花BR信號路徑被激活。外施BL或通過VIGS干涉Gb14-3-3c和Gb14-3-3d都能增強棉花對黃萎病菌的抗性。說明BR信號路徑可能對棉花抗黃萎病起到正向調(diào)控的作用。檢測BL處理后?！?124’根系中SA和JA相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)JA信號路徑相關(guān)基因的表達量上調(diào)。這說明在棉花中BR所介導(dǎo)的信號路徑可能是處于JA信號路徑的上游，或BR與JA信號路徑有重疊或協(xié)同作用。
　　SA

8、和JA是植物抗病反應(yīng)中兩種非常重要的小分子激素。位于SA和JA信號傳導(dǎo)結(jié)點的調(diào)節(jié)因子在這兩種激素介導(dǎo)的抗病信號路徑交叉網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在我們的研究中分離到在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都受黃萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)的硬脂酰去飽和酶GbSSI2。通過VIGS干涉掉GbSSI2后，干涉植株的莖和葉片組織都出現(xiàn)壞死斑，嚴重時會造成植株死亡。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，GbSSI2干涉植株體內(nèi)的活性氧大量積累;同時SA含量升高，SA路徑相關(guān)基因表達上調(diào);而JA含量降低，

9、JA相關(guān)基因的表達受到抑制。對干涉植株葉片進行離體接種實驗，發(fā)現(xiàn)干涉GbSSI2降低了棉花對黃萎病菌的抗性。說明GbSSI2可能參與負調(diào)控SA信號路徑，正調(diào)控JA路徑和棉花抗黃萎病。此外，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)棉花受黃萎病侵染后，JA信號路徑相關(guān)基因的表達上調(diào)。進一步說明了JA信號路徑在棉花抗黃萎病中可能存在的正向調(diào)節(jié)作用。
　　從棉花與黃萎病菌互作的轉(zhuǎn)錄表達譜中，分離得到一個受黃萎病菌侵染后差異表達的Homeodomain轉(zhuǎn)錄因子

10、HDTF1。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，其屬于HD家族PINTOX類成員。表達模式分析發(fā)現(xiàn)，HDTF1在棉花的葉片組織中優(yōu)勢表達;受黃萎病菌及灰霉病菌侵染后顯著下調(diào)表達;同時其表達還受SA的強烈誘導(dǎo)，但MeJA處理后，HDTF1的表達會受到抑制。利用VIGS方法把棉花中HDTF1基因干涉后，植株對黃萎病菌以及灰霉病菌的抗性明顯增強。研究結(jié)果表明，HDTF1可能作為一個負調(diào)控因子，調(diào)節(jié)棉花的抗病性。隨后的研究發(fā)現(xiàn)HDTF1干涉植株體內(nèi)JA含量增