新鋅指蛋白HZF1的功能研究.pdf

1、造血是人一生中不斷由多能造血干細(xì)胞更新造血祖細(xì)胞和成熟血細(xì)胞的過程?，F(xiàn)在認(rèn)為造血干細(xì)胞分化定向到某一個(gè)特定血細(xì)胞鏈系以及進(jìn)一步分化發(fā)育為成熟細(xì)胞的過程至少部分地是由鏈系特異的轉(zhuǎn)錄因子和廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用所控制。一些包含C2H2鋅指模體的轉(zhuǎn)錄因子在血細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中扮演了重要角色。例如GATA家族、FOG和EKLF等。 我組2000年從人骨髓cDNA文庫中篩選到一個(gè)新的編碼鋅指蛋白(命名為HZF1)的cDNA(Ge

2、nBank注冊(cè)號(hào)：AF244088)。本論文在此基礎(chǔ)上研究HZF1基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能和作用機(jī)制。 對(duì)hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒別到HZF1基因的3種轉(zhuǎn)錄物，它們可能由HZF1初級(jí)轉(zhuǎn)錄物不同的剪接產(chǎn)生。分析發(fā)現(xiàn)HZF1基因包含四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子。其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄物包含第3、4號(hào)外顯子，第二個(gè)包含第1、3、4號(hào)外顯子，第三個(gè)轉(zhuǎn)錄物包含有全部4個(gè)外顯子。這三種轉(zhuǎn)錄物的序列差異僅在5’非翻譯區(qū)，因

3、此編碼的肽鏈?zhǔn)且恢碌?。HZF1編碼區(qū)長2010bp，編碼670個(gè)氨基酸殘基，其中包含連續(xù)的15個(gè)C2H2型和2個(gè)C2R2型鋅指模體。 HZF1mRNA在人的腦、心、骨骼肌、腎、肝、胰腺和胎肝中高表達(dá)；在脾、小腸和骨髓組織中等表達(dá)；在結(jié)腸、胸腺、肺和外周血白血病中少量表達(dá)。HZF1mRNA在各種造血細(xì)胞系中都有表達(dá)。在hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化過程中HZF1mRNA表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)24h后HZF1mRNA表達(dá)水平到達(dá)最高

4、。同樣，在PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核系分化過程中HZF1mRNA表達(dá)上升，誘導(dǎo)60h后表達(dá)水平達(dá)到峰值。 把HZF1完整讀框插入到pEGFP-N1質(zhì)粒中，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-HZF1，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)HZF1融合蛋白定位在細(xì)胞核中。 為了制備HZF1特異抗體，把編碼HZF1非鋅指區(qū)的DNA順序插入到pET30a原核表達(dá)載體，構(gòu)建了pET30a-HZF1重組質(zhì)粒，

5、在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白HZF1-His5，并通過鎳柱對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了純化。以純化的蛋白作為免疫抗原，對(duì)新西蘭兔實(shí)施多次多點(diǎn)皮下注射免疫，獲得兔抗人HZF1免疫血清。ELISA檢測顯示血清效價(jià)在1：100000以上。證明所獲抗體能夠與HZF1特異結(jié)合。HZF1特異抗體的獲得為進(jìn)一步研究HZF1功能，并為組織和細(xì)胞中HZF1的檢測奠定了一定基礎(chǔ)。 為了分析HZF1在K562細(xì)胞分化中的功能作用，構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)HZF1

6、反義RNA的質(zhì)粒(pcDNA3.1antiHZF1)，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。通過聯(lián)苯胺染色和RT-PCR檢測γ-globin表達(dá)的方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空載體K562pcDNA3.1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞(對(duì)照)在hemin誘導(dǎo)下能夠正常向紅系分化。而在K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，HZF1內(nèi)源表達(dá)被阻遏，并且hemin誘導(dǎo)的紅系分化被抑制。通過PI染色和Giemsa染色的方法，發(fā)現(xiàn)對(duì)照K562pcDNA3.1穩(wěn)定

7、轉(zhuǎn)染細(xì)胞在PMA誘導(dǎo)下能夠正常向巨核系細(xì)胞分化，但是K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞PMA誘導(dǎo)的巨核系分化明顯減弱。我們進(jìn)一步以真核表達(dá)載體pAVu6為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并插入能表達(dá)干擾RNA以特異抑制HZF1mRNA的短DNA順序，構(gòu)建了RNA干擾質(zhì)粒pAVu6HZF1i，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)K562pAVu6HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細(xì)胞中，HZF1內(nèi)源表達(dá)被阻遏，并且顯著抑制了hemin誘導(dǎo)的紅系分化

8、和明顯減弱了PMA誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞分化?？傊梅戳xRNA和RNA干擾實(shí)驗(yàn)一致地證明了鋅指蛋白HZF1在K562細(xì)胞紅系分化和巨核系分化過程中具有重要作用。 利用雙螢光報(bào)告基因載體系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)HZF1蛋白非鋅指區(qū)具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活作用，并證明其中的一個(gè)肽段(從第49到第197氨基酸)具有幾乎和整個(gè)非鋅指區(qū)相同強(qiáng)度的轉(zhuǎn)錄激活作用。這些說明鋅指蛋白HZF1可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄活化蛋白，并且其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于第49到第197氨基酸區(qū)域。