棉花中兩個膜聯(lián)蛋白基因功能初步分析.pdf

1、棉纖維是由胚珠外的單個表皮細(xì)胞分化發(fā)育而來的，棉纖維發(fā)育的各個時期中有多種不同的基因共同參與纖維形態(tài)的建成。因此明確棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因功能不僅具有生產(chǎn)意義，而且有助于闡明單細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)理。
　　 棉花生活的環(huán)境中，常常遭受外界的各種危害，比如干旱、鹽堿、低溫、病蟲害等都嚴(yán)重影響棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量，因此培育高抗性棉花品種是棉花育種工作的重要任務(wù)之一。
　　 膜聯(lián)蛋白(annexin)是一類依賴Ca2+膜結(jié)合蛋白，廣泛存

2、在于除酵母外的真核生物細(xì)胞中，并且形成在進(jìn)化上保守的多基因家族。在植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫和刺激的過程中起作用。
　　 我實驗室前期從棉花高品質(zhì)7235材料中克隆得到兩個膜聯(lián)蛋白基因(GhFAnn1和GhFAnnx)。本研究對這兩個基因進(jìn)行逆境誘導(dǎo)表達(dá)分析，同時通過構(gòu)建不同類型正反義表達(dá)載體，獲得了轉(zhuǎn)這兩個基因共六個載體的轉(zhuǎn)基因純系材料，為進(jìn)一步闡明該類基因的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　 對抗逆棉花品種晉棉

3、19，進(jìn)行各種非生物脅迫處理，包括冷害、PEG6000、NaCl、ABA和SA，采用實時熒光定量PCR方法分析兩個膜聯(lián)蛋白基因受非生物脅迫后的表達(dá)情況。結(jié)果顯示GhFAnn1受干旱、冷害、ABA和SA誘導(dǎo)后表達(dá)強(qiáng)烈，而受Nacl誘導(dǎo)表達(dá)不強(qiáng)烈。GhFAnnx受PEG6000和SA誘導(dǎo)表達(dá)明顯，受ABA誘導(dǎo)表達(dá)不明顯，而受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)下調(diào)。研究結(jié)果表明GhFAnn1和GhFAnnx基因都不同程度的參與了棉花對非生物脅迫的響應(yīng)。

4、　　 利用已克隆的兩個膜聯(lián)蛋白基因構(gòu)建了6個植物表達(dá)載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因材料的培育，針對獲得該基因的不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因純系材料，分析了不同克隆純系的表達(dá)特征和纖維品質(zhì)檢測結(jié)果。
　　 首先利用兩個膜聯(lián)蛋白基因(GhFAnn1和GhFAnnx)構(gòu)建了6個不同植物表達(dá)載體，GhFAnn1基因正義表達(dá)載體(SAnn1)，反義表達(dá)載體(AsAnn1)和3‘端特異片段反義表達(dá)載體(3AsAnn1)。GhFAnnx基因正義表達(dá)載體(SAnn2

5、)、反義表達(dá)載體(AsAnn2)和干擾載體(IAnn2)。進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)基因材料培育，在前人研究獲得部分轉(zhuǎn)基因T1和T2代植株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行不同轉(zhuǎn)基因克隆系的鑒定工作。經(jīng)過PER、卡那霉素抗性檢測，共獲得6個不同表達(dá)載體的多個克隆純系，包括轉(zhuǎn)GhFAnn1基因正義克隆14個純系，反義克隆3個純系，3'端特異片段反義克隆4個純系；轉(zhuǎn)GhFAnnx基因正義克隆6個純系，反義克隆1個純系，干擾克隆3個純系。對轉(zhuǎn)基因克隆純系的纖維發(fā)育不同時期

6、進(jìn)行Q-PCR分析，SAnn1的克隆純系中，克隆編號為2-2、110-2、84-3和80-1-1等4個克隆純系表達(dá)量高于非轉(zhuǎn)基因材料W0，克隆編號為57-1、77-1-2、96-2、110-4-2、110-6-2、110-7-3、107-4-1、107-5-1和107-7-1等9個克隆的纖維發(fā)育不同時期的表達(dá)量明顯低于非轉(zhuǎn)基因材料W0，推測目標(biāo)基因在這些轉(zhuǎn)基因材料中的表達(dá)受共抑制所致；AsAnn1純系中克隆編號67-1，140-1和15

7、7-1等3個克隆的表達(dá)量與對照相近；3AsAnn1的4個純系材料的表達(dá)量都低于非轉(zhuǎn)基因材料W0.SAnn2的克隆純系中，克隆編號32-1表達(dá)升高，而其他克隆材料的表達(dá)都受到抑制；AsAnn2的克隆純系中中，克隆編號2-10DPA時表達(dá)水平高于對照，而其他時期卻低于對照；IAnn2的克隆純系中，克隆編號2-1-1中的目標(biāo)基因的在纖維中表達(dá)幾乎被完全抑制，而83-1-3表達(dá)量增強(qiáng)，編號18-1在0DPA和5DPA時的表達(dá)升高，10DPA到2

8、0DPA表達(dá)卻被完全的抑制了。目標(biāo)基因在不同克隆載體的轉(zhuǎn)基因純系中，其表達(dá)特征仍需進(jìn)一步驗證。
　　 經(jīng)過兩年纖維品質(zhì)檢測結(jié)果表明，與對照相比，轉(zhuǎn)SAnn1的純合株系107-7-1和80-1-1棉纖維長度顯著變長，馬克隆值和比強(qiáng)度與對照相比也有顯著變化。編號2-2、57-1、107-5-1和110-7-3的4個克隆的轉(zhuǎn)基因材料纖維長度都明顯變短，比強(qiáng)度沒有明顯變化，而其他轉(zhuǎn)基因材料的各項纖維品質(zhì)指標(biāo)與對照沒有顯著變化。轉(zhuǎn)AsAn

9、n1各個純和株系纖維長度沒有明顯的變化，其中，克隆67-1和157-1比強(qiáng)度和馬克隆值與對照相比差異顯著和極顯著。3AsAnn1轉(zhuǎn)基因材料中，克隆63-2纖維長度比對照顯著變短，其他克隆的各項纖維品質(zhì)指標(biāo)沒有明顯變化。SAnn2轉(zhuǎn)基因材料中，克隆編號42-1纖維長度比對照顯著變短，其他克隆的纖維品質(zhì)各項指標(biāo)沒有明顯變化，AsAnn2轉(zhuǎn)基因材料中，克隆2-1纖維長度比對照極顯著變短，馬克隆值和比強(qiáng)度沒有變化，IAnn2轉(zhuǎn)基因材料中的3個克