快速研究棉花基因功能的VIGS技術(shù)平臺的初步構(gòu)建.pdf

1、棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其生長周期比較長，適宜不同地區(qū)和國家栽培，品種差異很大。棉花植株棉酚類物質(zhì)含量比較豐富，離體培養(yǎng)的組織或器官很容易被氧化，組織培養(yǎng)和離體操作比較困難，效率比較低。主要栽培的陸地棉和海島棉是異源四倍體，基因組比較大，生長周期長，造成棉花基因功能研究的過程工作量大，且基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行功能分析比較困難。此前棉花基因功能研究和分子生物學(xué)研究還不是很成熟，而且棉花的EST數(shù)據(jù)庫信息缺乏，極大限制了棉花分子生物學(xué)

2、的發(fā)展；但隨著野生棉雷蒙德氏棉 D基因組和栽培棉亞洲棉 A基因組測序完成，棉花數(shù)據(jù)庫得到了很大的擴(kuò)展。給后續(xù)的棉花分子生物學(xué)研究奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)，所以快速高效進(jìn)行棉花基因功能研究的方法是十分必要的。
　　在過去的植物基因功能研究中，創(chuàng)建突變體和轉(zhuǎn)基因技術(shù)是有效的基因功能研究方法。但是對棉花來說，生長周期長和獲得穩(wěn)定的突變體比較困難，所以一種快速高效地進(jìn)行棉花基因組功能研究方法始終是追尋的目標(biāo)。VIGS（virus-induced

3、genesilence）是一種利用修飾過的病毒作為載體，整合內(nèi)源目的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體能引起轉(zhuǎn)錄后目的基因沉默的技術(shù)。在本研究中大規(guī)模轉(zhuǎn)基因研究表明，VIGS是一種效率高、速度快、操作簡便、可信度大、能夠進(jìn)行棉花從營養(yǎng)器官到生殖器官高效快速分析基因功能的實用技術(shù)。
　　本論文主要以修飾過的雙生病毒載體pCLCrVA和pCLCrVB來研究棉花內(nèi)源基因GhACNAT的生物學(xué)功能為主要研究內(nèi)容。經(jīng)生物信息學(xué)分析，GhACNAT屬于?；D(zhuǎn)移

4、酶(EC2.3.1.)家族基因，該酶家族主要催化?；霓D(zhuǎn)移，參與脂質(zhì)的合成與代謝。通過注射的方式將構(gòu)建好的VIGS-GhACNAT系統(tǒng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入陸地棉 C312幼苗子葉中，檢測為陽性的植株進(jìn)行深層次地探究，主要從GhACNAT-silence植株性狀，相關(guān)基因表達(dá)分析，內(nèi)源基因互作和代謝通路等方面進(jìn)行分析。GhACNAT-silence植株營養(yǎng)器官生長無明顯異常，而生殖器官出現(xiàn)了花粉囊不開裂、花絲變短、柱頭開裂扭曲、部分花粉失活、棉鈴大小

5、形態(tài)異常等表型。GhACNAT-silence植株與陰性對照株CK（轉(zhuǎn)入pCLCrV-空載）生殖器官基因表達(dá)差異經(jīng)cDNA-AFLP技術(shù)分析得出，其中脂質(zhì)，糖類和氨基酸的代謝過程關(guān)鍵酶基因表達(dá)顯著改變，GhACNAT-silence植株中脂質(zhì)的合成與代謝和茉莉酸合成相關(guān)的一些基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著的降低，經(jīng)GC-MS測定的茉莉酸含量及其顯著降低。驗證試驗中經(jīng)外源 MeJA（茉莉酸甲酯）處理，GhACNAT-silence植株中花粉囊不開