大鼠RSA14-44基因功能的初步研究.pdf

1、本研究選擇大鼠RSA14-44基因作為研究對(duì)象.RSA14-44基因位于大鼠染色體4q31,該基因是中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)激光捕獲顯微切割(Laser Capture Microdissection,LCM)技術(shù),構(gòu)建大鼠初級(jí)精母細(xì)胞cDNA削減文庫(kù),并進(jìn)一步用斑點(diǎn)雜交(Dot Blotting)分析,通過(guò)在互連網(wǎng)上的比對(duì)獲得的新基因.全長(zhǎng)為1124bp,可讀編碼框自100bp_684bp,編碼194個(gè)氨基酸,

2、推測(cè)其編碼蛋白質(zhì)分子量為21.8Kda.本研究中,首先利用RT-PCR檢測(cè)了RSA14-44在多個(gè)組織中的表達(dá),證明其在睪丸、附睪及腦組織中呈高表達(dá),這為進(jìn)一步對(duì)其功能的研究提供了新的思路.其次,將RSA14-44 cDNA克隆到pET30a(+)載體,在大腸桿菌中進(jìn)行了pET30a(+)-14融合蛋白的表達(dá)與純化.以純化的pET30a(+)-14融合蛋白免疫新西蘭大白兔,最后獲得了抗pET30a(+)-14融合蛋白的多克隆抗體.利用該

3、抗體進(jìn)行的免疫組化研究顯示,RSA14-44蛋白主要定位于大鼠睪丸生精上皮組織中的初級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和支持細(xì)胞.據(jù)此,又構(gòu)建了包含RSA14-44 cDNA的pAS2-1-14重組克隆,并以其作為誘餌質(zhì)粒,進(jìn)行人睪丸cDNA文庫(kù)的酵母雙雜交篩選,獲得了一條編碼人20S蛋白酶體蛋白PSMB5的cDNA片段.進(jìn)一步將RSA14-44cDNA和PSMB5克隆到pEGFP-N1載體,構(gòu)建成功綠色熒光融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-14和pEG

4、FP-N1-PSMB5,將兩種質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,借助碘化丙啶染色的細(xì)胞化學(xué)熒光技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),RSA14-44蛋白都定位在CHO細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),PSMB5在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá).將RSA14-44和PSMB5 cDNA分別克隆到pEGFP-N1和pDsRed1-N1載體中,在CHO細(xì)胞中進(jìn)行的共定位研究顯示,兩種蛋白呈完全共定位.以上實(shí)驗(yàn)充分證明RSA14-44和PSMB5蛋白存在相互作用,為此,我們研究了RS

5、A14-44和PSMB5相互作用后對(duì)泛素水解酶酶活性的影響,進(jìn)行了初步的分析,發(fā)現(xiàn)二者單獨(dú)作用時(shí)可分別顯著提高泛素水解酶酶活性,并且共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)極顯著地提高了酶活性,這表明兩者相互作用可能對(duì)生物學(xué)功能具有協(xié)同作用.研究中雙雜交實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)外驗(yàn)證的結(jié)果首次表明,RSA14-44和PSMB5蛋白在體內(nèi)外存在相互作用;從RSA14-44和PSMB5蛋白在細(xì)胞及組織中的定位,細(xì)胞蛋白酶體活性分析結(jié)果推測(cè),在精子發(fā)生過(guò)程中,RSA14-44和PS