RPS16家族基因功能的初步研究.pdf

1、ANK6是錨蛋白家族成員，通過其ankyrin錨重復(fù)序列介導(dǎo)蛋白相互作用。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，ANK6是調(diào)控植物受精過程中雌雄配子識(shí)別的關(guān)鍵成員。它在線粒體中通過與轉(zhuǎn)錄起始因子SIG5相互作用，控制植物中雌雄配子體識(shí)別的這一過程。ANK6不僅定位在線粒體，還定位在細(xì)胞核中。因此，進(jìn)一步篩選與ANK6互作的蛋白，對(duì)于研究ANK6調(diào)控雌雄配子識(shí)別的分子機(jī)制，以及探討ANK6在細(xì)胞核中的功能，都具有重要的意義。
　　 在前期工作中

2、，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，以ANK6為“誘餌”，篩選擬南芥的cDNA文庫，獲得了一個(gè)新的與ANK6互作的蛋白序列，它是核糖體小亞基蛋白R(shí)PS16家族成員RPS16C的N端氨基酸殘基序列。RPS16家族共有3個(gè)成員，分別被命名為RPS16A、RPS16B、RPS16C。它們的基因序列以及蛋白序列的同源性很高。
　　 為了進(jìn)一步證明RPS16與ANK6之間的相互作用，我們利用熒光雙分子互補(bǔ)技術(shù)，證實(shí)RPS16家族成員的全長(zhǎng)序列與ANK6

3、在擬南芥細(xì)胞核中相互作用。而且，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)三個(gè)RPS16家族成員與ANK6相互作用的部位都在其N端(～71aa)。奇怪的是，RPS16成員全長(zhǎng)蛋白在酵母系統(tǒng)中并不能與ANK6發(fā)生相互作用，這有可能是擬南芥的RPS16蛋白在酵母中不能正確折疊導(dǎo)致其N端功能區(qū)失活所致。
　　 通過GFP標(biāo)簽分別構(gòu)建RPS16A/B/C的融合表達(dá)質(zhì)粒，再分別轉(zhuǎn)進(jìn)擬南芥的原生質(zhì)體，在熒光顯微鏡下觀察到熒光信號(hào)都在細(xì)胞核中，表明RPS1

4、6家族的三個(gè)成員定位在擬南芥細(xì)胞的細(xì)胞核中。為進(jìn)一步確定RPS16家族成員的亞細(xì)胞定位，我們還分別構(gòu)建了RPS16家族單個(gè)成員帶GFP標(biāo)簽的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。在激光共聚焦顯微鏡下，觀察到發(fā)出綠色熒光的部位能與通過細(xì)胞核核熒光染料DAPI染色的信號(hào)完全重合，證明了RPS16家族的三個(gè)蛋白都定位在擬南芥的細(xì)胞核中。
　　 應(yīng)用帶GUS標(biāo)簽的質(zhì)粒，分別構(gòu)建含RPS16家族成員啟動(dòng)子序列的融合表達(dá)質(zhì)粒，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)RPS16家族成

5、員的啟動(dòng)子活性的研究發(fā)現(xiàn)，RPS16A與RPS16B在擬南芥的根、葉、花絲、花藥以及柱頭中有明顯表達(dá)，而RPS16C則在擬南芥的根與葉中表達(dá)。RPS16家族成員中的RPS16A與RPS16B在擬南芥組織中的表達(dá)模式一致，而與RPS16C存在一些差異，暗示RPS16A與RPS16B在功能上存在冗余。
　　 RPS16家族各成員的T-DNA插入突變體及過表達(dá)植株，在正常和高鹽、滲透等脅迫環(huán)境下，其表型與對(duì)照野生型擬南芥都沒有明顯差異