幽門螺桿菌hp0530基因功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori,H.pylori)是唯一可以定植在人和動(dòng)物胃粘膜的革蘭陰性、呈多形性的微需氧細(xì)菌，是消化道疾病的主要致病菌，與某些消化道之外的疾病也要有一定關(guān)系，世界范圍內(nèi)感染率超過60％[1]。H.pylori的CagA等毒力因子是通過Cag致病島編碼的IV型分泌系統(tǒng)注入宿主細(xì)胞中，經(jīng)過一系列的級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮其毒力作用而致病。目前關(guān)于cag致病島基因的功能尚未完全明確，其致病機(jī)制也在

2、研究之中。因此,本文以cag致病島中的hp0530基因?yàn)檠芯繉ο?通過分子生物學(xué)、微生物學(xué)等技術(shù)初步探討了hp0530基因的功能。
　　方法：
　　1.克隆與表達(dá)hp0530基因
　　根據(jù)Genbank中H.pylori26695全基因序列，利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得hp0530抗原性較強(qiáng)的基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-hp0530，導(dǎo)入表達(dá)工程Rosetta；經(jīng)I

3、PTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳鑒定，Ni2+-NTA柱分離純化；復(fù)性濃縮得到重組Hp0530融合蛋白。
　　2.制備鼠源多克隆抗血清
　　純化后的Hp0530融合蛋白免疫昆明小鼠，制備抗hp0530多克隆抗血清，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測抗血清效價(jià)。
　　3．構(gòu)建與鑒定hp0530基因缺失株
　　利用基因打靶技術(shù)，設(shè)計(jì)PCR引物并擴(kuò)增hp0530基因上下游同源臂片段，構(gòu)建hp0530基因缺失株重組自殺質(zhì)粒

4、，即pBlueKM40-△hp0530::kan。電轉(zhuǎn)化法使自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)入H.pyloriNCTC26695菌體中，利用卡那霉素抗性篩選出同源重組成功的陽性菌株，并使用PCR、酶切等技術(shù)驗(yàn)證后，得到H.pylori hp0530基因缺失株：△hp0530。
　　4.檢測△hp0530的生長繁殖狀況
　?。?）檢測正常培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的野生株26695和缺失株△hp0530的OD值，比較二者的生長情況。
　　（2）檢測將野生

5、株26695和缺失株△hp0530與胃上皮細(xì)胞GES-1分別共同培養(yǎng)后的不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)，比較二者的生長情況。
　　5.檢測hp0530蛋白的亞細(xì)胞定位
　　收集并裂解與胃上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的幽門螺桿菌，采用超高速離心法對其進(jìn)行亞細(xì)胞分離，分離后的組分包括膜蛋白（包括內(nèi)膜和外膜）、胞質(zhì)蛋白以及周質(zhì)間隙蛋白。利用western blot實(shí)驗(yàn)，以鼠抗hp0530多克隆抗血清為一抗，明確hp0530蛋白在菌體中的亞細(xì)胞定位
　

6、　6.檢測與胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)后的△hp0530缺失株對CagA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、和宿主細(xì)胞IL-8分泌功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1. PCR擴(kuò)增獲得hp0530的部分基因片段為510 bp，相對分子質(zhì)量約為24 KD。
　　2.克隆表達(dá)技術(shù)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得了重組hp0530融合蛋白的多克隆抗血清，其效價(jià)為1:32000
　　3.成功構(gòu)建了hp0530基因缺陷重組自殺質(zhì)粒pBlueKM40-△hp0530::

7、kan，并獲得了H.pylori hp0530基因缺陷株：△hp0530。
　　4..生長曲線繪制結(jié)果顯示：△hp0530缺失株的生長狀況與野生株26695比較沒有明顯差別，對宿主細(xì)胞的侵襲亦沒有明顯差異，并且不影響CagA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，但影響宿主細(xì)胞分泌IL-8的量。
　　5. Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hp0530蛋白位于細(xì)菌膜組分，包含內(nèi)外膜部分。
　　結(jié)論：
　　野生株26695的hp0530的較