一個(gè)植物羧基末端蛋白酶基因功能的初步研究.pdf

1、羧基末端蛋白酶(Carboxyl.terminal Protease，CTP)是植物細(xì)胞內(nèi)一類功能未知的家族蛋白，其特征是在氨基酸序列的羧基端均存在一個(gè)高度保守的DUF239序列，且不同的CTP蛋白分布于植物細(xì)胞的細(xì)胞核、質(zhì)膜、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及胞外空間等亞細(xì)胞區(qū)域。由此推測(cè)，該蛋白家族對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育可能有重要作用。 本研究構(gòu)建了一個(gè)陸地棉CTP蛋白編碼基因(GhCtp)的反義基因以及GhCtp-gfp融合基因植物表達(dá)

2、載體，并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將其轉(zhuǎn)入煙草中，試圖通過研究該基因在煙草細(xì)胞內(nèi)的過量表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響來闡明該基因的生物學(xué)功能。 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GhCtp基因轉(zhuǎn)化煙草 以煙草K326無菌苗離體葉片為受體，分別將構(gòu)建好的GhCtp反義基因和融合基因植物表達(dá)載體通過根癌農(nóng)桿菌LBA4404進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。侵染的葉片接入共培養(yǎng)基(MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AS 10 mg/L)上培

3、養(yǎng)1～2d后依次轉(zhuǎn)接至分化篩選培養(yǎng)基(MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Hyg 20mg/L十Cef 500 mg/L)及生根篩選培養(yǎng)基(MS+Hyg 20 mg/L+Cef 500 mg/L)中，分別獲得轉(zhuǎn)反義基因抗性苗15個(gè)株系(70株苗)和轉(zhuǎn)融合基因抗性苗8個(gè)株系(35株苗)。通過PCR及PCR-Southern檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)反義基因株系中有12個(gè)株系呈陽性，轉(zhuǎn)融合基因株系中有6個(gè)株系呈陽性。 2

4、.GhCtp基因功能的初步分析 通過對(duì)轉(zhuǎn)反義GhCtp 基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的觀察，發(fā)現(xiàn)在葉形、花期、花形和花色四個(gè)方面與對(duì)照出現(xiàn)明顯差異。 ①葉形變化：在葉齡相同的情況下，轉(zhuǎn)反義GhCtp基因植株葉片寬度較對(duì)照株有所增大繼而葉形發(fā)生變化，根據(jù)長(zhǎng)寬比分析，其中4個(gè)株系(A、B、C、E)與對(duì)照有極顯著差異，葉形為寬橢或橢圓形；2個(gè)株系(F、H)呈顯著差異，葉形為橢圓形；而對(duì)照株為長(zhǎng)橢形。 ②花期變化：轉(zhuǎn)反義GhCtp基

5、因株系比對(duì)照株系不同程度地提前進(jìn)入花期，提前最少為10d，最多為47d。但這種變化與煙草中的早花現(xiàn)象明顯不同。 ③花形變化：在各個(gè)株系的開花盛期進(jìn)行觀察分析，轉(zhuǎn)反義GhCtp基因植株中4個(gè)株系(A、C、D、H)花冠長(zhǎng)在5.38～5.90 cm之間，直徑在2.48～3.06 cm之間(對(duì)照花冠長(zhǎng)均在5.0 cm以下，直徑在2.4 cm以下)?；ü陂L(zhǎng)及直徑與對(duì)照有極顯著差異。 ④花色變化：所有轉(zhuǎn)反義GhCtp基因植株系的花色