棉花GhGalT1基因的表達(dá)及功能研究.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum)是我國乃至世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，棉纖維是紡織業(yè)的主要原材料。另外，棉花是研究纖維細(xì)胞生長發(fā)育及細(xì)胞壁生物合成的理想材料之一。因此，分離鑒定棉纖維發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，研究其表達(dá)模式及其在棉纖維發(fā)育中的功能，對于闡明棉纖維生物合成的分子機(jī)理，進(jìn)一步提高棉花產(chǎn)量及改良纖維品質(zhì)具有重要意義。
　　 富含羥脯氨酸的糖蛋白(Hydroxyproline-rich glycoprotein，H

2、RGP)是植物細(xì)胞壁蛋白中的一個超家族，可分為三類：輕微糖基化的富含脯氨酸的蛋白(Proline-richproteins，PRPs)、中度糖基化的伸展蛋白(Extensins，EXTs)和高度糖基化的阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan-proteins，AGPs)。HRGPs的合成經(jīng)歷了由脯氨酸羥化酶(prolyl4-hydroxylases，P4Hs)催化的脯氨酸(Pro)到羥脯氨酸(Hyp)的翻譯后修飾，隨后在羥脯

3、氨酸上進(jìn)行由糖基轉(zhuǎn)移酶催化的O-糖基化修飾。AGPs是一類糖基化程度最高的細(xì)胞壁蛋白，只含有不到10％分子量的蛋白質(zhì)主鏈，多糖側(cè)鏈則占了分子量的90％以上，意味著多糖側(cè)鏈可能決定著分子間相互作用及其功能。但關(guān)于AGPs多糖側(cè)鏈生物合成的酶學(xué)卻知之甚少，多糖側(cè)鏈在AGPs功能發(fā)揮中的實際作用也未知。因此，分離鑒定棉纖維發(fā)育相關(guān)的參與AGP合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，研究其生物學(xué)功能，具有重要意義。
　　 本研究從棉花cDNA文庫中分離克隆了

4、1個可能糖基化AGPs的編碼β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，命名為GhGalT1，對其表達(dá)、亞細(xì)胞定位及功能進(jìn)行了研究，取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.GhGalT1基因的分離鑒定與序列分析
　　 從棉花cDNA文庫中克隆鑒定了1個編碼β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，命名為GhGalT1，cDNA開放閱讀框(ORF)全長為1053 bp，編碼的蛋白質(zhì)由350個氨基酸組成。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括N端的跨膜結(jié)構(gòu)域，C端保守的Ga

5、lT功能結(jié)構(gòu)域，屬于GT31家族成員。序列比對和進(jìn)化關(guān)系分析表明，GhGalT1與楊樹PtGalT1、擬南芥ATGalT1和ATGalT2蛋白的同源性較高，親緣關(guān)系較近。
　　 2.GhGalT1基因在棉花不同組織及纖維發(fā)育階段的表達(dá)分析
　　 GhGalT1在棉花不同組織表達(dá)分析結(jié)果顯示：GhGalT1在棉花不同組織中均有表達(dá)。其中，該基因在下胚軸中表達(dá)量較高，在根和花藥中次之，在胚珠和纖維中也有不同程度的表達(dá)。進(jìn)一步

6、分析了該基因在纖維不同發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果表明GhGalT1在2 DPA纖維(含胚珠)和15 DPA纖維中表達(dá)較強(qiáng)。
　　 3.GhGalT1基因的啟動子分析
　　 通過染色體步移法分離出GhGalT1基因長度為528 bp的啟動子片段，PlantCARE程序分析顯示：GhGalT1啟動子不僅具有真核生物啟動子基本結(jié)構(gòu)元件，如TATA-box、CAAT-box等，還含有一些重要的與激素和脅迫相關(guān)的功能元件，如：MBS(M

7、YB參與干旱誘導(dǎo)的結(jié)合位點)、HSE和TC-rich(參與防御與脅迫反應(yīng)的順式作用元件)等。通過構(gòu)建GhGalT1啟動子：：GUS融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。對轉(zhuǎn)基因擬南芥各器官各發(fā)育階段的組織化學(xué)染色分析顯示：GhGalT1基因的啟動子主要在主根以及側(cè)根的根尖特異表達(dá)，并隨發(fā)育階段表達(dá)越強(qiáng)，在10天以后的子葉及蓮座葉邊緣也有微弱表達(dá)。脅迫和激素處理顯示：GhGalT1基因的啟動子受鹽、干旱和激素(6-BA、MeJA、BL等)的誘導(dǎo)。

8、r>　　 4.GhGalT1蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　 生物信息學(xué)預(yù)測顯示GhGalT1蛋白屬于Ⅱ型單次跨膜蛋白，定位于高爾基體上。構(gòu)建了GhGalT1：eGFP融合表達(dá)載體，通過與攜帶YFP的高爾基體標(biāo)記蛋白GONST1-YFP共轉(zhuǎn)煙草葉表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察瞬時表達(dá)結(jié)果顯示：GhGalT1與高爾基體標(biāo)記蛋白GONST1的定位相重疊，表明GhGalT1定位于高爾基體。
　　 5.GhGalT1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬

9、南芥幼苗發(fā)育早期的表型分析
　　 為研究GhGalT1在植物中可能的功能，構(gòu)建了GhGalT1過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得4個T3代的純合體，RT-PCR分析顯示GhGalT1在這4個轉(zhuǎn)基因株系中都有表達(dá)，其中在L1和L5中表達(dá)量最高，故選擇L1和L5為后續(xù)表型分析研究對象。此外，我們也分別鑒定了與GhGalT1同源的擬南芥At1g53290和At3g14960的T-DNA插入突變體SALK015338和SALK043252，

10、二者均為雙T-DNA反向插入的純合體。
　　 在種子萌發(fā)階段，野生型和過表達(dá)兩個株系未顯示明顯差異；但在幼苗生長階段，GhGalT1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗長勢明顯優(yōu)于野生型，其根長變長，生物量增多，而SALK043252突變體的根長短于野生型，生物量明顯降低。尤其在1/2MS不添加蔗糖的培養(yǎng)基上，過量表達(dá)株系與野生型表型差距更加明顯，過量表達(dá)株系中葉綠素含量增加，光合作用效率增強(qiáng)。在黑暗條件下，GhGalT1過量表達(dá)植株的下胚

11、軸顯著長于野生型，初步推測GhGalT1基因的功能可能與糖代謝相關(guān)。
　　 6.GhGalT1過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對阿拉伯糖和半乳糖的耐受性
　　 半乳糖對植物的生長具有毒害作用。生長于1/2 MS+75 mM Ara/Gal的GhGalT1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥長勢明顯優(yōu)于野生型和突變體，葉片直徑及根長明顯高于野生型，表明GhGalT1過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對阿拉伯糖和半乳糖的耐受性。
　　 7.細(xì)胞壁

12、合成相關(guān)基因在GhGalT1轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)分析
　　 分析了約20個參與細(xì)胞壁各組分生物合成的基因，發(fā)現(xiàn)參與果膠合成的GAUT8、GAUT9和xgd1基因在GhGalT1過表達(dá)株系中表達(dá)量明顯上調(diào)，推測GhGalT1可能促進(jìn)了果膠的合成；對細(xì)胞壁單糖組分的初步分析也表明果膠組分發(fā)生了變化。這表明GhGalT1基因可能通過參與AGP的合成進(jìn)而影響了果膠合成。
　　 8.GhGalT1過量表達(dá)及RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株的獲

13、得
　　 構(gòu)建了GhGalT1過量表達(dá)載體及RNA干擾(RNAi)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，目前已獲得GhGalT1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花15個株系，共計100多株轉(zhuǎn)基因棉花植株；提取了10個株系的基因組DNA(gDNA)，PCR檢測表明90％為陽性苗；獲得8個RNAi轉(zhuǎn)基因棉花株系，共約50株轉(zhuǎn)基因棉花植株，PCR分析表明所提取gDNA的植株檢測均為陽性。對轉(zhuǎn)基因棉花植株的表型有待進(jìn)一步分析探討。
　　 9.