棉花GhMAPK6的表達(dá)及功能分析.pdf

1、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子，它是以蛋白磷酸化的形式將細(xì)胞外的刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)特異性地放大信號(hào)，并引起細(xì)胞反應(yīng)的一類酶蛋白信號(hào)系統(tǒng)。MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)具有高度的保守性，包括3種蛋白激酶：即MAPKKK，MAPKK和MAPK，這3種激酶通過各種途徑將上游的信號(hào)受體和下游的效應(yīng)器聯(lián)系起來。MAPKKK是這個(gè)磷酸化途徑的第一部分，它能夠通過磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基來激活MAPKK，而MAPKK又通過磷酸化T—

2、loop的蘇氨酸和酪氨酸殘基來激活MAPK。
　　 脫落酸(ABA)是一種重要的植物激素，它在種子的形成、萌發(fā)、休眠、幼苗的生長(zhǎng)過程中具有重要的調(diào)控作用。另外，ABA在植物對(duì)環(huán)境的脅迫響應(yīng)中也具有重要作用。大量實(shí)驗(yàn)表明，在ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中MAPK發(fā)揮重要作用，MAPK參與并介導(dǎo)了ABA對(duì)脅迫的調(diào)控。植物中的MAPK與各種生理、發(fā)育和激素反應(yīng)相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，病原體、傷害、低溫、干旱、滲透、高鹽和活性氧都可能引起MAP

3、K在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平及酶活性的改變。實(shí)驗(yàn)證明，ABA能誘導(dǎo)H2O2的合成，而H2O2作為逆境脅迫應(yīng)答中的一個(gè)信號(hào)分子，在逆境脅迫應(yīng)答中能激活一些MAPK。本研究從棉花cDNA文庫中分離得到一個(gè)編碼MAPK蛋白的基因(命名為GhMAPK6)，對(duì)該基因的表達(dá)及功能等方面進(jìn)行了分析，取得如下主要研究結(jié)果：
　　 1．GhMAPK6基因的分離克隆及其編碼的蛋白質(zhì)序列分析從棉花cDNA文庫中分離克隆了1個(gè)編碼MAPK蛋白基因的cDNA，與擬

4、南芥中AtMAPK6的同源性高，因此命名為GhMAPK6。同時(shí)，利用PCR技術(shù)從棉花基因組中分離了長(zhǎng)3907bp的GhMAPK6基因全長(zhǎng)序列，通過與cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)，GhMAPK6基因的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。序列比較和進(jìn)化分析結(jié)果表明，GhMAPK6基因編碼的蛋白屬于A類MAPK蛋白。
　　 2．GhMAPK6基因在棉花中的表達(dá)分析利用qRT—PCR技術(shù)，對(duì)GhMAPK6基因在棉花組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了研

5、究。結(jié)果表明，GhMAPK6在棉花組織中呈組成型表達(dá)，在各組織中都有表達(dá)，其中在根和下胚軸中表達(dá)量相對(duì)較高。逆境脅迫實(shí)驗(yàn)表明，GhMAPK6在高鹽和干旱脅迫下，在根中表達(dá)水平升高。而且，GhMAPK6表達(dá)量隨著ABA處理的時(shí)間變化而變化，ABA處理1h后該基因表達(dá)水平開始升高，到5h時(shí)達(dá)一個(gè)最大值。據(jù)此推測(cè)GhMAPK6可能參與ABA應(yīng)答。
　　 3．GhMAPK6蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)利用eGFP報(bào)告基因，構(gòu)建這個(gè)基因ORF區(qū)域與e

6、GFP的融合表達(dá)載體，研究GhMAPK6的亞細(xì)胞定位。將GhMAPK6—eGFP轉(zhuǎn)化棉花下胚軸，獲得棉花愈傷組織。利用激光共聚焦顯微技術(shù)，觀察GhMAPK6—GFP融合蛋白的定位情況，結(jié)果表明，GhMAPK6定位在植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
　　 4．過量表達(dá)GhMAPK6基因能恢復(fù)擬南芥T—DNA插入突變體Atmkk1的表型為了研究GhMAPK6基因的功能，將GhMAPK6基因?qū)隩—DNA插入突變體Atmkk1擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植