CYR61介導(dǎo)DDR2過分泌MMP1的分子機制及其在RA滑膜細胞侵襲中的作用研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)致殘性病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?。與其他類型關(guān)節(jié)炎的區(qū)別在于，RA受累關(guān)節(jié)的主要病理表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、持續(xù)性滑膜炎、血管翳形成、滑膜組織異常增生以及軟骨和骨的進行性破壞等。RA發(fā)病早期T細胞依賴性自身免疫導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)發(fā)生炎性滲出，進入慢性期后非 T細胞依賴性滑膜過度增生、侵襲破壞關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨是RA晚期關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要原因。因此，深入研究 RA關(guān)節(jié)軟骨破壞相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，探尋其中的重要環(huán)節(jié)和關(guān)

2、鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，對于更好地防治RA有著極其重要的意義。
　　前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，在RA滑膜成纖維樣細胞中存在一種特殊的、具有受體酪氨酸蛋白激酶活性的盤狀結(jié)構(gòu)域受體 DDR2且呈高表達狀態(tài)；它以膠原為配體，通過同源二聚化使其胞內(nèi)區(qū)第471位酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，處于持續(xù)活化狀態(tài)，促進MMP1和MMP13的大量分泌，參與RA關(guān)節(jié)軟骨破壞；體外表達純化的 DDR2受體胞外區(qū)蛋白可與DDR2競爭性結(jié)合 II型膠原，抑制 RA FLS分

3、泌MMP1，在CIA大鼠模型中觀察到可溶性的DDR2可改善關(guān)節(jié)軟骨的破壞。因此，提出在RA滑膜組織增生侵襲破壞軟骨的進程中可能存在這樣一個惡性循環(huán)：在異常的自身免疫狀態(tài)下，軟骨脫落的 II型膠原激活滑膜成纖維樣細胞中的 DDR2受體，從而誘導(dǎo)滑膜成纖維樣細胞過表達MMPs；DDR2受體在膠原強大而持續(xù)的作用下持續(xù)活化，使得滑膜成纖維樣細胞不斷地分泌 MMPs，這些持續(xù)分泌的 MMPs對骨和軟骨產(chǎn)生嚴重的破壞；然而，被破壞的軟骨又可進一步

4、釋放大量的膠原物質(zhì)，隨即成為MMPs的誘導(dǎo)因素，如此反復(fù)，周而復(fù)始。
　　然而從膜受體DDR2活化到胞內(nèi)效應(yīng)分子MMPs的過度分泌，其中詳細的作用機制及關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子尚不清楚。CYR61是利用Agilent Human1A基因表達譜芯片對II型膠原刺激前后RA滑膜成纖維樣細胞進行差異分析獲得的基因，為了深入探討CYR61在DDR2-MMPs通路中扮演的角色及其對RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的作用，進行以下實驗研究：
　　首先，利用Re

5、al-time PCR、Western-blot以及免疫組化等實驗技術(shù)系統(tǒng)分析DDR2、CYR61以及MMPs在RA滑膜組織中的表達水平和表達分布，評價CYR61在RA發(fā)生、發(fā)展的臨床意義；其次，應(yīng)用Real-time PCR和蛋白免疫印跡觀察上調(diào)或者下調(diào)DDR2的活化水平對CYR61表達水平的影響并通過EMSA、雙熒光素酶報告基因、Real-time PCR和蛋白免疫印跡等方法闡明DDR2調(diào)控CYR61表達的分子機制，從而揭示 II型

6、膠原-DDR2-CYR61通路的存在；接著，以過表達腺病毒Ad-CYR61和CYR61 siRNA為研究工具，采用Real-time PCR和蛋白免疫印跡方法驗證CYR61對下游效應(yīng)分子MMPs的影響，同時，綜合運用生物信息學(xué)、雙熒光素酶報告系統(tǒng)、染色質(zhì)免疫共沉淀以及凝膠遷移實驗等實驗方法，深入探討CYR61調(diào)控MMPs表達的具體分子機制；然后，使用Transwell和細胞劃痕實驗檢測關(guān)鍵分子CYR61對RA滑膜成纖維樣細胞侵襲遷移功能

7、的影響；最后，通過構(gòu)建Wistar大鼠CIA模型，給予干涉腺病毒shCYR61局部治療，阻斷動物關(guān)節(jié)局部CYR61的表達，來評估腺病毒shCYR61對CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療效果。
　　通過以上實驗研究獲得了下列結(jié)果：① Real-time PCR結(jié)果顯示，RA患者滑膜組織中DDR2、CYR61以及MMP1、MMP9、MMP13的mRNA表達水平均高于OA患者滑膜組織，DDR2與CYR61 mRNA的表達水平呈正相關(guān)，CYR6

8、1與MMP1 mRNA的表達水平呈正相關(guān)。②蛋白免疫印跡結(jié)果同樣顯示，RA患者滑膜組織中DDR2、CYR61及MMP1的蛋白表達水平均顯著高于OA患者滑膜組織。免疫組化結(jié)果顯示，DDR2、MMP1均表達于滑膜襯里層，DDR2與MMP1在RA滑膜組織中的表達水平高于OA；CYR61則泛表達于多種組織中，RA滑膜及滑膜下結(jié)締組織中CYR61的表達水平高于OA。③利用Real-time PCR和蛋白免疫印跡觀察上調(diào)或者下調(diào)DDR2的活化水平對

9、CYR61表達水平的影響，結(jié)果顯示II型膠原刺激DDR2活化能夠促進CYR61的表達，干涉DDR2抑制CYR61的mRNA和蛋白表達水平。④ EMSA和雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示II型膠原誘導(dǎo)DDR2活化可增強轉(zhuǎn)錄因子AP-1在CYR61啟動子區(qū)域的結(jié)合活性，從而誘導(dǎo)CYR61轉(zhuǎn)錄活性升高，促進CYR61的表達。⑤ CYR61能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ETS1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達。⑥雙熒光素酶報告基因、ChIP和EMSA實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子

10、ETS1通過與MMP1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-122~-102 bp啟動子序列直接結(jié)合，增強MMP1的轉(zhuǎn)錄活性，促進MMP1的表達。⑦ Transwell和細胞劃痕實驗結(jié)果表明，CYR61能夠促進FLS細胞侵襲遷移功能。⑧動物實驗結(jié)果顯示，干涉 CYR61的表達能夠明顯降低關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，顯著改善關(guān)節(jié)軟組織腫脹程度；⑨ X射線和Micro-CT檢查結(jié)果提示，干涉腺病毒shCYR61對CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞具有良好的治療效果