miRNA-155介導ESAT-6誘導巨噬細胞凋亡的分子機制及其在結核診斷中的作用.pdf

1、目的:
　　結核感染仍是世界公共衛(wèi)生難題，據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)統(tǒng)計:2013年約有900萬新增活動型結核病人，其中高達150萬人因結核病而喪命。近年來隨著多重耐藥結核、廣泛性耐藥結核病的出現(xiàn)以及HIV-TB的合并感染，更加劇了目前結核病防控的嚴峻形勢。結核病的主要致病菌為結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），其主要潛伏感染人巨噬

2、細胞，并引起宿主細胞壞死裂解?？菇Y核免疫應答是機體清除結核分枝桿菌的重要環(huán)節(jié)。除作為Mtb的主要感染細胞，巨噬細胞同樣也是機體殺死結核分枝桿菌的重要效應細胞。已有研究表明:細胞凋亡在機體抗結核固有免疫應答中發(fā)揮重要作用，Mtb減毒株或無毒株可促進細胞凋亡發(fā)生，控制結核感染;然而Mtb強毒株可抑制凋亡并誘導細胞壞死，引起結核擴散。結核早期分泌抗原ESAT-6，作為結核分枝桿菌的重要毒力因子，在免疫調節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。已有研究顯示:結核早

3、期分泌抗原ESAT-6能夠促進巨噬細胞凋亡，有利于機體清除結核分枝桿菌，但其相關分子機制并不十分清楚。
　　在前期預實驗中，我們發(fā)現(xiàn):ESAT-6抗原刺激巨噬細胞后，能引起胞內(nèi)miR-155表達顯著升高，相關研究報道m(xù)iR-155參與了卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)介導的巨噬細胞凋亡，通過生物信息學預測分析，我們發(fā)現(xiàn)細胞信號抑制分子-1（suppressor of cytokine signal

4、ing-1，SOCS1）是miR-155的一個重要靶基因，且已有證據(jù)表明SOCSl可能是Mtb感染時巨噬細胞中調節(jié)細胞因子信號通路的一個關鍵分子，由此，我們推測miR-155與SOCS1相互作用可能參與了結核早期分泌抗原ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡過程。本研究擬在已有研究報道和我們前期工作基礎上開展如下工作:(1)明確結核抗原ESAT6處理巨噬細胞后，巨噬細胞內(nèi)miR-155、SOCS1的動態(tài)變化和時間特異性;(2)應用慢病毒轉染控制

5、miR-155及SOCS1表達，探討ESAT-6處理后，巨噬細胞中凋亡分子Caspase-3表達情況，明確miR-155及SOCS1在巨噬細胞凋亡中的作用;同時采用siRNA干擾技術控制Toll樣受體2(Toll-like receptor2，TLR2)及NF-κBp65表達，初步探討ESAT-6誘導miR-155表達上調的原因;(3)收集人外周血單個核細胞，熒光定量PCR檢測特定免疫分子及細胞因子表達情況，探討其在結核診斷中的作用。本

6、研究力圖為闡明ESAT-6在宿主免疫調節(jié)中的作用提供新的理論依據(jù)，同時亦為尋找新的結核病干預靶點及臨床結核病診治提供新的思路。
　　方法:
　　1.應用結核早期分泌抗原ESAT-6處理巨噬細胞系RAW264.7，收集經(jīng)處理后不同時間點細胞總RNA及蛋白，實時熒光定量PCR技術檢測胞內(nèi)miR-155、BIC、SOCS1、IL6及TNF-α及IFN-γ等mRNA表達水平; Western-blot技術檢測SOCS1、NF-κβ

7、p65及凋亡分子Caspase-3蛋白表達水平;同時，采用流式細胞儀檢測不同時間點細胞凋亡發(fā)生情況;
　　2.采用慢病毒過表達miR-155及抑制miR-155，實時熒光定量PCR技術檢測胞內(nèi)SOCS1、IL6及TNF-α mRNA表達變化;Western-blot技術檢測SOCS1及凋亡分子Caspase-3蛋白表達水平變化;并用流式細胞儀分析抑制miR-155后對細胞凋亡的影響;
　　3.采用慢病毒過表達SOCS1基因，

8、Westem-blot技術檢測凋亡分子Caspase-3蛋白表達水平;同時在過表達SOCS1的條件下，Western-blot技術及流式細胞術觀察miR-155對巨噬細胞凋亡的影響;
　　4.為了進一步弄清楚ESAT-6誘導miR-155表達上調的主要原因，我們采用了siRNA干擾技術，控制RAW264.7細胞內(nèi)TLR2及NF-κB p65的表達，并用Western-blot技術觀察TLR2及NF-κB p65干擾效果，以及實時熒

9、光定量PCR技術檢測細胞內(nèi)miR-155表達水平;
　　5.將研究人群分為三個組:正常對照組、活動型結核組及潛伏型結核組。收集人外周血單個核細胞，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測特定免疫分子(TLR2、BIC、miR-155、SOCS1)及細胞因子（TNFα、IL6、IL12p40、iNOS、IFN-γ）mRNA表達水平。
　　結果:
　　1.ESAT-6處理巨噬細胞24h內(nèi)，細胞凋亡分子活性Caspase

10、-3表達不斷增加;流式細胞檢測結果亦表明ESAT-6能夠顯著促進巨噬細胞凋亡發(fā)生，并有時間依賴效應;此外，研究結果顯示miR-155、BIC及相關細胞因子mRNA表達水平隨ESAT-6處理時間不斷增加，而SOCS1表達水平隨時間增加而不斷下降;
　　2.單獨過表達miR-155能顯著抑制SOCS1表達，提高巨噬細胞凋亡分子CleavedCaspase-3表達，并促進巨噬細胞凋亡發(fā)生。采用慢病毒抑制miR-155表達，巨噬細胞內(nèi)SO

11、CS1表達明顯升高，而細胞因子如IL6，TNF-α等表達顯著減少，細胞凋亡受到明顯抑制;
　　3.過表達SOCS1基因可抑制ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡;而在過表達SOCS1條件下，過表達miR-155則可恢復Cleaved Caspase-3表達及大部分巨噬細胞凋亡的發(fā)生。
　　4.成功構建TLR2及NF-κB p65-siRNA干擾細胞系，結果發(fā)現(xiàn)抑制TLR2表達能顯著降低ESAT-6介導的NF-κB p65表達，并干

12、擾細胞內(nèi)miR-155的表達，提示TLR2/NF-κB活化可能是ESAT-6誘導miR-155表達上調的主要原因。
　　5.Q-PCR檢測人外周血單個核細胞中特定免疫調節(jié)分子（TLR2，BIC，miR-155及SOCS1）和細胞因子結果表明:TLR2，BIC，miR-155以及SOCS1在各組別中差異表達，進一步統(tǒng)計分析提示miR-155/SOCS1比值可能區(qū)分活動型結核及潛伏型結核感染。
　　結論:
　　1.miR-

13、155在ESAT-6介導的巨噬細胞免疫活化及凋亡過程中具有重要作用;
　　2.miR-155可能通過靶向作用SOCS1參與調控結核早期分泌抗原ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡發(fā)生;
　　3.ESAT-6誘導的miR-155表達上調與巨噬細胞內(nèi)TLR2/NF-κB活化相關;
　　4.TLR2，BIC，miR-155以及SOCS1或可作為結核病診斷的新型生物標記分子。
　　綜上所述，TLR2/NF-κB/miR-155

14、/SOCS1信號參與了ESAT-6介導的巨噬細胞凋亡過程，miR-155在ESAT-6介導的巨噬細胞免疫反應中發(fā)揮重要作用，這可能揭示了結核早期分泌抗原ESAT-6在宿主免疫調節(jié)作用中的新機制。同時，本研究提示TLR2/NF-κB/miR-155/SOCS1或可作為宿主免疫調節(jié)治療的重要靶標，為結核治療研究增添了新的內(nèi)容;此外，人群研究提示TLR2，BIC，miR-155及SOCS1或可作為活動型結核及潛伏型結核診斷的重要指標，為結核病