Cyr61在肝臟祖細(xì)胞增殖中的作用及其與肝癌關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 在正常的肝臟，肝臟祖細(xì)胞(hepatic progenitor cells，HPCs)/卵圓細(xì)胞(hepatic ovalcells，HOC)處于休眠狀態(tài)，然而當(dāng)肝細(xì)胞的增殖受到損傷時(shí)(如慢性的肝臟疾病)，HPCs/HOC被活化，代替肝細(xì)胞介導(dǎo)病理性的肝再生過(guò)程，越來(lái)越多的研究已經(jīng)證明HPCs/HOC在HCC的形成中發(fā)揮重要的作用，在許多嚙齒類的HCC動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)了在HCC的形成前優(yōu)先出現(xiàn)HOC的增殖，各種各

2、樣的化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物肝臟形成腫瘤，其癌變的過(guò)程主要為致癌物抑制了正常肝細(xì)胞的增殖和修復(fù)功能，而卵圓細(xì)胞活化、增殖，代替肝細(xì)胞的功能修復(fù)嚴(yán)重受損的肝臟組織。并且慢性肝臟疾病中出現(xiàn)HPCs的增殖增加了HCC形成的風(fēng)險(xiǎn)。HPCs被發(fā)現(xiàn)參與一系列肝臟損傷性疾病，并且在肝纖維化和肝臟腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。富半胱氨酸蛋白61(Cysteine rich61，Cyr61/CCN1)是CCN蛋白家族成員之一，是分泌型的、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與

3、調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程，如分化、轉(zhuǎn)移、增殖、血管形成、細(xì)胞粘附、存活和凋亡。在干細(xì)胞中，Cyr61是主要信號(hào)通路的介導(dǎo)者。但是，Cyr61和肝臟祖細(xì)胞的具體關(guān)系仍不清楚。同樣Cyr61被發(fā)現(xiàn)在多種類型的腫瘤組織中過(guò)表達(dá)并且在腫瘤形成的過(guò)程中Cyr61發(fā)揮多種不同的功能。但是目前，Cyr61在HCC中的作用仍存在爭(zhēng)議，并且兩者的確切關(guān)系及其機(jī)理尚不清楚。本研究首先分析了HCC組織、癌周肝硬化組織和正常成人肝臟組織中Cyr61的表達(dá)和HP

4、Cs活化的關(guān)系。然后對(duì)Cyr61在2-AAF/PHx大鼠肝損傷模型中對(duì)HOC活化增殖的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步研究。最后，觀察并分析了Cyr61調(diào)控肝干細(xì)胞增殖的作用和機(jī)制以及Cyr61對(duì)HepG2細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤的作用。本研究不僅為深入研究Cyr61在HPCs/HOC應(yīng)答以及肝臟腫瘤形成中發(fā)揮的生物學(xué)效能及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并且對(duì)尋找肝癌早期診斷的標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。
　　 方法：
　　

5、1.病人標(biāo)本中Cyr61的表達(dá)和HPCs活化增殖的關(guān)系的研究
　　 1.1采用HE、免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)5例正常成人肝臟組織，30例癌周肝硬化組織，35例HCC組織中HPCs活化增殖的情況。
　　 1.2免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)Cyr61在5例正常成人肝臟組織，30例癌周肝硬化組織，35例HCC組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)行半定量分析Cyr61表達(dá)的差異，分析人肝臟組織中Cyr61表達(dá)和HPCs增殖的關(guān)系。
　　

6、 1.3免疫組織化學(xué)SP染色法、免疫熒光雙標(biāo)激光共聚焦檢測(cè)的方法觀察病人標(biāo)本中Cyr61在活化的HPCs中的表達(dá)情況。
　　 2.Cyr61在2-AAF/PHx大鼠肝損傷模型中對(duì)HOC活化增殖的作用及其機(jī)制的初步研究。
　　 2.1檢測(cè)分析2-AAF/PHx大鼠肝損傷模型肝臟組織中Cyr61的表達(dá)和HOC活化增殖的關(guān)系。
　　 2.1.1 HE、免疫組織化學(xué)SP染色法，檢測(cè)HOC在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟

7、組織中活化增殖的情況。
　　 2.1.2采用免疫組織化學(xué)SP染色、組織透射電鏡觀察的方法，對(duì)2-AAF/PHx大鼠模型肝臟中活化增殖的HOC進(jìn)行鑒定。
　　 2.1.3 Western blotting的方法檢測(cè)Cyr61在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中HOC活化增殖過(guò)程中的表達(dá)情況以及β-catenin信號(hào)通路的異常激活情況。
　　 2.22-AAF/PHx大鼠肝損傷模型中下調(diào)Cyr61的異常表達(dá)對(duì)β-c

8、atenin信號(hào)通路的抑制作用及HOC增殖的影響的檢測(cè)及分析。
　　 2.2.1應(yīng)用肝臟原位注射并孵育Cyr61抗體的方法，抑制2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61的異常表達(dá)。
　　 2.2.2 Western blotting檢測(cè)2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61是否被抑制。
　　 2.2.3 Western blotting檢測(cè)2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中下調(diào)Cyr61的表達(dá)后，

9、β-catenin以及其下游靶基因cyclinD1表達(dá)水平的變化。
　　 2.2.4組織HE染色的方法檢測(cè)2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中下調(diào)Cyr61的表達(dá)對(duì)HOC的激活和增殖的影響。
　　 3.Cyr61調(diào)節(jié)HOC和肝癌細(xì)胞株HepG2增殖作用的研究。
　　 3.1 HOC的分離、培養(yǎng)、鑒定以及Cyr61調(diào)控HOC增殖作用及其機(jī)制的初步研究。
　　 3.1.1兩步膠原酶消化法分離培養(yǎng)2-AAF/P

10、Hx大鼠模型肝臟組織中增殖的HOC；免疫熒光染色法、透射電鏡法，對(duì)分離的HOC進(jìn)行鑒定。
　　 3.1.2應(yīng)用HEK293細(xì)胞對(duì)重組腺病毒AdCyr61、AdRFP進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞感染及滴度測(cè)定，并用獲得的病毒裂解液感染HOC獲得瞬時(shí)高表達(dá)外源性Cyr61的AdCyr61-HOC以及對(duì)照細(xì)胞AdRFP-HOC。
　　 3.1.3 Western blotting檢測(cè)AdCyr61感染HOC后細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)情況。MT

11、T實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cyr61對(duì)HOC增殖的影響。
　　 3.1.4 Western blotting檢測(cè)AdCyr61-HOC和AdRFP-HOC中β-catenin信號(hào)通路的活化情況。
　　 3.1.5分別用AdCyr61瞬時(shí)感染和抗體封閉的方法過(guò)表達(dá)和抑制HOC中Cyr61的表達(dá)后，用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性的變化。
　　 3.2 NOD/SCID小鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)觀察分析體內(nèi)Cyr

12、61對(duì)HepG2細(xì)胞成瘤作用的影響。
　　 3.2.1人肝癌細(xì)胞株HepG2分別被AdCyr61、AdRFP感染36h后，分別采用RT-PCR、Western blot的方法檢測(cè)感染AdCyr61的實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞中Cyr61的mRNA和蛋白的表達(dá)和對(duì)照組細(xì)胞AdRFP-HepG2相比是否上調(diào)。
　　 3.2.2將AdCyr61-HepG2細(xì)胞和AdRFP-HepG2接種于NOD/SCID小鼠皮下，觀察Cyr61對(duì)皮

13、下瘤生長(zhǎng)的影響并繪制皮下瘤成長(zhǎng)曲線。
　　 3.2.3采用HE、免疫組織化學(xué)SP染色法分別檢測(cè)Cyr61對(duì)HepG2皮下瘤形態(tài)的影響以及核增殖因子Ki67的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.5例(100％)正常成人肝臟組織中均未發(fā)現(xiàn)門脈周圍HPCs和非典型小管樣增殖(atypical ductular proliferations，ADP)反應(yīng)；30例(100%)癌周肝硬化組織中均出現(xiàn)明顯的HPCs的激活和ADP反

14、應(yīng)；25例(71%)HCC組織中存在HPCs的激活和ADP反應(yīng)。并且在癌周肝硬化和HCC組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應(yīng)從肝硬化結(jié)節(jié)或癌結(jié)節(jié)周圍向肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)散。
　　 2.Cyr61在癌周肝硬化組織中的表達(dá)明顯升高，并且在增生的間質(zhì)中可見大量激活的單個(gè)HPCs和呈小管樣反應(yīng)的HPCs，Cyr61在其中也均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；HCC中癌結(jié)節(jié)周圍的間質(zhì)中也出現(xiàn)了HPCs的大量增生和同樣的小管

15、樣反應(yīng)，周圍伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并且Cyr61在HPCs中的表達(dá)和癌細(xì)胞相比顯著增高。
　　 3.HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)和免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)HPCs標(biāo)志蛋白OV6，共同分析病人標(biāo)本中出現(xiàn)HPCs激活和ADP反應(yīng)的情況，發(fā)現(xiàn)HPCs激活和增殖的程度與Cyr61表達(dá)的升高相伴隨，并且Cyr61和OV6在HPCs中共表達(dá)。
　　 4.2-AAF/PHx大鼠模型中，部分肝切除(partial hepatectomy，PH)后第

16、2d在門脈區(qū)就出現(xiàn)HOC的增殖，主要為單個(gè)或散在的HOC，PH后第9d，HOC進(jìn)一步活化增殖，形成的小管樣結(jié)構(gòu)大量增加，侵入肝實(shí)質(zhì)中部，OV6免疫組織化學(xué)SP染色胞漿呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，第21d已經(jīng)基本恢復(fù)正常。
　　 5.Cyr61在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中HOC活化增殖過(guò)程中的表達(dá)上調(diào)，Cyr61的表達(dá)在PH后第1d即開始增高，PH后第3d、5d、7d達(dá)高峰，PH第9d后逐漸恢復(fù)正常值。
　　 6.β-cate

17、nin信號(hào)通路在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中HOC活化增殖過(guò)程中異常激活，其關(guān)鍵分子GSK-3β的表達(dá)沒有發(fā)生變化，但是其發(fā)生磷酸化與Cyr61的異常表達(dá)一致，并且β-catenin的激活也和Cyr61的異常表達(dá)相伴隨。β-catenin信號(hào)通路下游和HOC增殖相關(guān)的靶基因CyclinD、Survivin和Cyr61的異常表達(dá)也一致，均伴隨著HOC的活化增殖而升高。
　　 7.下調(diào)2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cy

18、r61的表達(dá)可以抑制β-catenin、CyclinD的異常表達(dá)并使HOC的增殖減少。
　　 8.PH后第9d的2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中分離培養(yǎng)了增殖的HOC并進(jìn)行了鑒定和培養(yǎng)，過(guò)表達(dá)外源性的Cyr61后，GSK-3β的磷酸化水平升高呈失活形式，β-catenin的磷酸化水平降低而活性升高，外源性的Cyr61可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并可以使β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性顯著升高，并且β-catenin下游靶基因Cycl

19、inD、Survivin的表達(dá)升高。
　　 9.外源性的Cyr61可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HepG2在NOD/SCID小鼠皮下瘤的生長(zhǎng)，并且使皮下瘤組織Ki67的表達(dá)增多，提示Cyr61在體內(nèi)可以促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在正常肝組織中無(wú)門脈周圍HPCs和ADP增殖。在癌周肝硬化和HCC組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應(yīng)從肝硬化結(jié)節(jié)或癌結(jié)節(jié)周圍向肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)

20、散，并且Cyr61在激活的HPCs中表達(dá)異常增高。提示Cyr61在HCC形成過(guò)程中發(fā)揮的重要作用可能和HPCs的激活有密切的關(guān)系。
　　 2.2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61的表達(dá)在HOC活化增殖的過(guò)程中明顯升高，當(dāng)HOC分化為正常肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞后又恢復(fù)正常水平，并且β-catenin信號(hào)通路的異常激活和Cyr61的升高相伴隨，提示Cyr61可能和β-catenin協(xié)同作用，在激活HOC，促進(jìn)其增殖方面發(fā)揮重要的

21、作用，并共同促進(jìn)HOC的活化增殖；采用抗體封閉的方法下調(diào)2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61的表達(dá)可以抑制β-catenin信號(hào)的異常激活并使HOC的增殖減少，提示Cyr61對(duì)HOC活化增殖作用可能依賴于β-catenin的異常激活啟動(dòng)下游靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 3.外源性Cyr61在體外可以促進(jìn)HOC的增殖，并可以減少β-catenin的磷酸化降解，調(diào)節(jié)β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性，促使其作用于下游增殖因子發(fā)揮作