人脂聯(lián)素球狀結構域(gAd)促進3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的代謝機制研究.pdf

1、目的
　　 探討人脂聯(lián)素球狀結構域(globulardomainofadiponectin,gAd)促進3T3-L1脂肪細胞攝取葡萄糖后,葡萄糖可能的代謝去路。
　　 方法
　　 培養(yǎng)并分化3T3-L1脂肪細胞,分化成熟后用油紅O染色法進行脂質鑒定；透析復性gAd,完成透析后以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。以含有不同濃度gAd(10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、300ng／mL、1000ng／mL)的

2、干預液干預分化成熟的3T3-LI脂肪細胞5h；收集干預液殘液以葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度,并以實時熒光定量(realtimePCR,RT-PCR)法測定細胞內糖酵解途徑關鍵酶己糖激酶(hexokinase,HK)、6-磷酸果糖激酶-1(6-phosphofructokinase—1,PFK—1)、丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)在轉錄水平表達的變化,同時測定脂肪酸合成代謝關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoAca

3、rboxylase,ACC)、脂肪酸分解代謝關鍵酶肉堿脂酰轉移酶Ⅰ(carnitinepalmitoyltransferaseⅠ,CPT-Ⅰ)、甘油三酯合成代謝關鍵酶甘油-3-磷酸酰基轉移酶(sn-glycerol-3-phosphateacyltransferase,GPAT)、磷酸戊糖途徑關鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6PD)在轉錄水平表達的變化；以蛋白免疫印跡法(Westernblot)測

4、定PK和CPT-Ⅰ在翻譯水平表達的變化。用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件建立數據庫分析數據,數據以均數±標準差(M±S.D)表示,檢驗水準α=0.05。
　　 結果
　　 1.gAd對3T3-L1脂肪細胞攝取葡萄糖能力的影響
　　 各組細胞干預液殘液中葡萄糖濃度差異顯著(F=98.065,P=0.000)。其中,各實驗組(gAd濃度依次為10、50、100、300、1000ng／mL)殘液中葡萄糖濃度均顯著低于對照

5、組(P均<0.01),且100ng／mLgad組較50ng／mLgAd組也降低(P<0.01)。進一步對殘液中葡萄糖濃度降低程度與gAd濃度進行相關性分析顯示,在相同作用時間內,隨著gAd濃度的增加葡萄糖濃度降低程度逐漸增加(r=0.699,F=10.721,P=0.005)。
　　 2.gAd對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖酵解關鍵酶(HK、PFK-1、PK)表達的影響
　　 各組細胞HK轉錄水平的表達差異顯著(F=125

6、.789,P=0.000)。其中,各實驗組(pAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達與對照組相比均顯著增加(P均<0.01),且高劑量實驗組對HK表達的上調作用均顯著高于前一低劑量實驗組(P均<0.05)。各組細胞PFK-1在轉錄水平的表達差異顯著(F=85.399,P=0.000)。其中10ng／mLgAd組表達與對照組相比無差別(P=0.295),其余各實驗組(gAd濃度分別為50、100、300、100

7、0ng／mL)表達與對照組比較均顯著增加(P均<0.01),且50ng／mL、100ng／mL、300ng／mLgAd組對其表達的上調作用均顯著高于前一低劑量實驗組(P均<0.05)。各組細胞PK在轉錄水平的表達差異顯著(F=113.661,P=0.000)。其中,10ng／mLgAd組表達與對照組比較無差別(P=0.073),其余各實驗組(gAd濃度分別為50、100、300、1000ng／mL)表達與對照組比較顯著增加(P均<0.0

8、1),且高劑量實驗組對PK表達的上調作用均顯著高于前一低劑量實驗組(P均<0.05)。由此可知,gAd對于HK、PFK-1、PK在轉錄水平的表達均有上調作用。.同時Westernblot結果顯示,各組細胞PK在翻譯水平的表達同樣差異顯著(F=161.007,P=0.00),其中,50、100、300、1000ng／mLgAd組的表達顯著高于對照組(P均<0.01)。
　　 3.gAd對3T3-L1脂肪細胞中脂肪代謝相關關鍵酶(G

9、PAT、ACC、CPT-1)表達的影響
　　 各組細胞GPAT在轉錄水平的表達(對照組、10ng／mLgAd組、50ng／mLgAd組、100ng／mLgAd組、300ng／mLgAd組、1000ng／mLgAd組)無差別(F=1.400,P=0.292)；各組細胞ACC在轉錄水平的表達差異顯著(F=32.546,P=0.000),其中,各實驗組(gAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達與對照組相比均

10、顯著增加(P均<0.05),且50ng／mLgAd實驗組對其表達的上調作用顯著高于10ng／mLgAd實驗組(P<0.05);各組細胞CPT-Ⅰ在轉錄水平的表達差異顯著(F=381.854,P=0.000),其中各實驗組(gAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達均顯著高于對照組(P均<0.01),且高劑量實驗組對其表達的上調作用均顯著高于前一低劑量實驗組(P均<0.01)。該結果說明,gad對3T3-L1脂肪

11、細胞內GPAT在轉錄水平的表達無影響,對ACC和CPT-Ⅰ在轉錄水平的表達具有上調作用。同時,Westernblot結果顯示,各組細胞CPT-Ⅰ在翻譯水平的表達同樣差異顯著(F=268.099,P=0.000),其中各實驗組(gAd濃度分別為10、50、100、300、1000ng／mL)表達與對照組相比顯著增加(P均<0.01)。
　　 4.gAd對3T3-L1脂肪細胞磷酸戊糖途徑關鍵酶(G6PD)表達的影響
　　 各

12、組細胞G6PD在轉錄水平的表達(對照組、10ng／mLgAd組、50ng／mLgAd組、100ng／mLgAd組、300ng／mLgAd組、1000ng／mLgAd組)無差別(F=1.545,P=0.248)。
　　 結論
　　 1.本課題組制備的原核基因重組gAd可以促進3T3-L1脂肪細胞攝取胞外葡萄糖,說明本課題組制備的原核基因重組gAd具有野生活性。
　　 2.gAd促進3T3-L1脂肪細胞攝取葡萄糖的同