Gata1調(diào)控的miRNA144-451對(duì)貧血影響的初步研究.pdf

1、miR-144和miR-451是一個(gè)雙順?lè)醋觤iRNA基因位點(diǎn)。miR-451的表達(dá)重約占據(jù)紅細(xì)胞發(fā)育晚期miRNA的50％。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-144/451在紅細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中和珠蛋白合成過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。β地中海貧血患者的前體紅細(xì)胞中miR-451的表達(dá)明顯增高，miR-144/451參與β地中海貧血的發(fā)生發(fā)展，那么我們猜想miR-144/451是否也在其他類型的貧血中發(fā)揮著重要的作用呢？
　　主要進(jìn)行

2、以下實(shí)驗(yàn):
　　1）建立缺鐵性動(dòng)物模型、慢性失血性貧血?jiǎng)游锬Ｐ汀⒑妥⑸浔诫轮氯苎载氀獎(jiǎng)游锬Ｐ?
　　2）檢測(cè)miR-144/451在各種貧血模型中的外周血、骨髓以及小鼠胚胎肝紅細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì);
　　3）研究分析miR-144/451在貧血?jiǎng)游锬Ｐ椭斜磉_(dá)增高的分子機(jī)制及其臨床意義。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，本研究旨在明確miR-144/451與除β地中海貧血以外的其他類型貧血的關(guān)系，闡明miR-144/451與貧血關(guān)系的可能分子機(jī)

3、制。
　　1.三種小鼠貧血模型的建立及其miR-144/451的表達(dá)
　　目的:
　　通過(guò)物理、化學(xué)等方法建立小鼠貧血模型，觀察缺鐵性貧血小鼠的精神狀態(tài)，皮膚黏膜情況等，用于研究缺鐵性貧血狀態(tài)下miR-144/451表達(dá)情況。
　　方法:
　　1）21天大小的C57BL/6小鼠（斷奶小鼠）用缺鐵性飼料(購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司Trophic Animal Feed High-Tech Co.，Ltd，

4、China)飼養(yǎng)，并且在缺鐵性飼料飼養(yǎng)小鼠期間同時(shí)喂食超純水以避免水中鐵元素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。然后在飼養(yǎng)缺鐵飼料后的第4-5周目?jī)?nèi)眥采集小鼠外周血檢測(cè)，記錄相關(guān)指標(biāo)變化，檢測(cè)小鼠貧血程度。并提取小鼠外周血紅細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-144和miR-451的表達(dá)情況。
　　2）C57BL/6小鼠通過(guò)腹腔注射濃度為65mg/kg的苯肼溶液，于注射前和注射后的1，2，3，4，5，6，7天

5、目?jī)?nèi)眥采集小鼠外周血檢測(cè)，記錄相關(guān)指標(biāo)變化，檢測(cè)小鼠貧血程度。并提取小鼠外周血紅細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-144和miR-451的表達(dá)情況。
　　3）每?jī)商鞛镃57BL/6小鼠目?jī)?nèi)眥放血一次，每次放200μl，連續(xù)放血6次。在最后一次放血后，目?jī)?nèi)眥采集小鼠外周血檢測(cè)，記錄相關(guān)指標(biāo)變化，檢測(cè)小鼠貧血程度。并提取小鼠外周血紅細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運(yùn)用qRT-PCR技

6、術(shù)檢測(cè)miR-144和miR-451的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　小鼠出現(xiàn)貧血癥狀，各組小鼠的皮膚和粘膜顏色蒼白，外周血紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞比例增高，小鼠表現(xiàn)為貧血狀態(tài)。取小鼠外周血并提取其RNA檢測(cè)其miR-144/451的表達(dá)，miR-144/451的表達(dá)增高。
　　結(jié)論:
　　建立了小鼠貧血模型，可以為用于檢測(cè)miR-144/451表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)。貧血狀態(tài)下miR-144/4

7、51的表達(dá)增高說(shuō)明miR-144/451可能參與貧血的發(fā)生發(fā)展。
　　2.臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血樣本miR-144/451的表達(dá)
　　目的:
　　明確miR-144/451在臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血樣本中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討miR-144/451與貧血的關(guān)系及其機(jī)制研究提供支持。
　　方法:
　　收集臨床缺鐵性貧血樣本、腫瘤貧血病人血樣本和再生障礙性貧血樣本。并且提取紅細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDN

8、A，并運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-144和miR-451的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血病人血樣本紅細(xì)胞中miR-144/451的表達(dá)增高，但是再生障礙性貧血病人血樣本中紅細(xì)胞miR-144的表達(dá)無(wú)明顯變化而miR-451表達(dá)減低。
　　結(jié)論:
　　臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血病人血樣本紅細(xì)胞中miR-144/451的表達(dá)增高說(shuō)明miR-144/451可能參與病人缺鐵性貧血和腫瘤貧血病人貧

9、血過(guò)程的發(fā)生發(fā)展，并且其作用機(jī)制不同于再生障礙性貧血疾病。
　　3.miR144/451在貧血過(guò)程中的功能研究
　　目的:
　　利用上述建造的小鼠貧血模型和臨床貧血樣本中miR-144/451在紅細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過(guò)相同條件同時(shí)處理miR-144/451敲除小鼠和野生型小鼠，觀察兩種類型小鼠貧血情況。探究miR-144/451在貧血過(guò)程中的功能。
　　方法:
　　利用上述方法同時(shí)處理相同年齡，相同性別的m

10、iR-144/451敲除小鼠和野生型小鼠，檢測(cè)兩種小鼠外周血常規(guī)變化情況;制作外周血涂片，并進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色明確小鼠外周血中紅細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量變化;運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠外周血和骨髓中的紅細(xì)胞，明確紅細(xì)胞的分化成熟度;運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量，明確紅細(xì)胞成熟度;檢測(cè)小鼠脾臟的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)變化，明確各組小鼠的代償性造血水平;磁珠分選小鼠骨髓有核紅細(xì)胞WB檢測(cè)GATA1表達(dá);qRT-PCR檢測(cè)小鼠骨髓有核紅細(xì)胞中抗氧化

11、應(yīng)激酶包括SOD、Catalase、GPX1、NQO1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1）外周血涂片瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果提示:與貧血處理過(guò)的wt組小鼠比較，miR144/451敲除組小鼠外周血紅細(xì)胞形態(tài)并改善，紅細(xì)胞大小不均勻，細(xì)胞破碎，中心淡染區(qū)增大，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多;
　　2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示:與貧血處理過(guò)的wt組小鼠比較，miR-144/451敲除組小鼠的外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞比例增加，且骨髓及外周血的紅細(xì)

12、胞成熟度減低;
　　3）脾臟形態(tài)學(xué)及組織學(xué)結(jié)果提示:與貧血處理過(guò)的wt組小鼠比較，miR-144/451敲除組小鼠的脾臟偏大，重量增大，提示小鼠體內(nèi)代償性造血功能減弱;與未處理過(guò)的wt組小鼠相比，處理過(guò)的貧血wt小鼠GATA1表達(dá)增高，抗氧化酶表達(dá)量下降。
　　結(jié)論:
　　1）miR-144/451敲除小鼠和經(jīng)處理過(guò)的wt貧血小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平增加;
　　2)由于經(jīng)處理過(guò)的wt貧血小鼠miR-144/451表