利用RNA干涉技術(shù)研究Smad2和Smad3在鼠成纖維細(xì)胞TGF-β信號通路中的不同作用.pdf

1、RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)的一種特異性基因表達(dá)沉默,是一種古老但在進(jìn)化上又高度保守的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。關(guān)于RNAi的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究迅速成為21世紀(jì)初生命科學(xué)的熱點之一,在人、小鼠及其他哺乳動物中,RNAi已廣泛應(yīng)用于基因功能驗證、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因治療等領(lǐng)域的研究。由于哺乳動物缺乏體內(nèi)siRNA介導(dǎo)的沉默放大效應(yīng),利用DNA載體在細(xì)胞內(nèi)

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄出siRNAs,并維持長時間抑制效果的方法已被證明是行之有效的。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β,transforming growth factors beta),在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和物質(zhì)代謝等方面均有極其重要的作用,而Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受體胞內(nèi)激酶底物,在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵的作用。本研究通過構(gòu)建RNAi的DNA表達(dá)載體,特異地、有效地抑制TGF-β/Smads信號通路中通路特異性Smads-S

3、mad2和Smad3基因在NIH/3T3小鼠成纖維細(xì)胞中的表達(dá),分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平研究Smad2和Smad3的不同作用和相互關(guān)系及在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中所處的地位。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.確定了外源TGF-β1誘導(dǎo)NIH/3T3細(xì)胞中Smads蛋白表達(dá)的最佳濃度和時間。通過設(shè)置添加TGF-β1處理的不同濃度梯度和時間梯度,利用半定量RT-PCR.和Western-blottting分析方法確定誘導(dǎo)Smads

4、蛋白達(dá)到最高表達(dá)量的濃度和時間分別為5μg/L和3小時,并發(fā)現(xiàn)Smad3的表達(dá)對TGF-β1的刺激尤為敏感,從0.5小時起一直持續(xù)高效表達(dá)。
　　 2.構(gòu)建了靶基因的shRNADNA表達(dá)載體。按照siRNA的設(shè)計規(guī)則,針對Smad2和Smad3基因分別設(shè)計了5條21bp的siRNA序列,合成了10條62-64bp的雙鏈DNA寡核苷酸序列,并將它們分別插入到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen質(zhì)粒載體中

5、,獲得了包括陽性和陰性對照的12個shRNA的DNA表達(dá)質(zhì)粒,并經(jīng)酶切和測序驗證。
　　 3.建立了一套比較有效的RNAi的技術(shù)體系。將所獲得12個RNAi表達(dá)質(zhì)粒利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染NIH/3T3小鼠成纖維細(xì)胞,提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA和總蛋白質(zhì),采用半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析了siRNA抑制效果,獲得了兩個特異地、有效地抑制Smad2和Smad3表達(dá)的RNAi表達(dá)質(zhì)粒。分析這兩個有效的

6、siRNA序列發(fā)現(xiàn),正義鏈第10位的堿基在設(shè)計中具有重要的作用,當(dāng)?shù)?0位為U時,抑制效率最高,其次是C,最后是A/G。
　　 4.分析了Smad2和Smad3在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的不同作用。在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別檢測了Smad2-depleption細(xì)胞、Smad3-depleption細(xì)胞和Smad2+3-depleption細(xì)胞中Smad2、Smad3和Smad4的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在Smad2-depleption

7、細(xì)胞中Smad3和Smad4的表達(dá)提高,而在Smad3-depleption細(xì)胞中Smad2的表達(dá)沒有發(fā)生改變,Smad4的表達(dá)降低。表明TGF-β信號在NIH/3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,Smad3起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
　　 5.建立了混合RNAi表達(dá)質(zhì)粒有效地抑制靶基因表達(dá)的方法。分別針對于Smad2和Smad3 mRNA序列不同區(qū)段的4個shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合,構(gòu)成Smad2-RNAi池和Smad3-RNAi池,利用脂質(zhì)體