補(bǔ)陽(yáng)還五湯大鼠含藥血清對(duì)肺成纖維細(xì)胞TGF-β1-Smad-ERK信號(hào)通路調(diào)控研究.pdf

1、目的：考察補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清對(duì)肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞模型TGF-βl、TGF-βlmRNA、Smad3、Smad4、Smad7、ERK1/2、p-ERK表達(dá)的影響，初步探討具有“益氣活血”功效的補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗肺纖維化的分子機(jī)制，拓寬補(bǔ)陽(yáng)還五湯的臨床應(yīng)用空間。
　　方法：⑴采用一次性氣管滴入博萊霉素的經(jīng)典造模方法制備肺纖維化大鼠模型，第14天處死動(dòng)物，肉眼觀察肺組織外觀形態(tài)改變，制備病理切片，采用蘇木素-伊紅染色法(haematoxy

2、lin-eosine，HE)、Masson三色染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變；⑵采用組織塊法對(duì)肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代分離培養(yǎng)。用0.25％胰蛋白酶消化，按1：2傳代培養(yǎng)。第4代用于實(shí)驗(yàn)；⑶采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)上清中TGF-βl的表達(dá)；⑷采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測(cè)細(xì)胞中的TGF-βl蛋白基因的表達(dá)；5.采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Smad3、Smad4、Smad7蛋白及ER

3、K1/2、p-ERK的表達(dá)。
　　結(jié)果：①肉眼觀察可見(jiàn)雙肺呈暗紅色，光澤度差，肺組織表面粗糙不平，可見(jiàn)散在出血點(diǎn)和瘀斑；HE染色結(jié)果提示，肺泡壁增厚，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)僅見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞明顯增多；Masson染色結(jié)果顯示各級(jí)支氣管及血管外壁、增厚的肺泡隔內(nèi)均可見(jiàn)藍(lán)色膠原纖維沉積，提示此時(shí)ECM增多，促進(jìn)大量纖維增生；②肺組織塊貼壁72 h后，鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，將組織塊去除，第7d左右梭形細(xì)胞在局部融合成

4、片，20d左右細(xì)胞接近完全融合，傳代后第2代細(xì)胞7d左右接近完全融合，第3代以后融合時(shí)間為5d。成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形形態(tài)，常呈漩渦狀生長(zhǎng)；③ELISA檢測(cè)上清中TGF-βl的表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性組和20%含藥血清組，10%含藥血清組肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)均有顯著減少（P<0.01），5%含藥血清組細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)有減少趨勢(shì)，三組不同濃度的補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清作用效果表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；④REAL-

5、TIME PCR檢測(cè)細(xì)胞中的 TGF-βl蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性組和20%含藥血清組肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)均有顯著減少（P<0.01）；10%含藥血清組肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)減少（P<0.05），5%含藥血清組細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)有減少趨勢(shì)，三組不同濃度的補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清作用效果表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；⑤Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Smad3

6、、Smad4、Smad7蛋白及ERK1/2、p-ERK的表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組比較，20%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞中Smad3蛋白的表達(dá)顯著減少（P<0.05），陽(yáng)性組，10%和5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組成纖維細(xì)胞中Smad3蛋白表達(dá)有減少趨勢(shì)；陽(yáng)性組和不同濃度補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組肺成纖維細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)有減少趨勢(shì)；20%含藥血清組纖維化肺細(xì)胞中Smad7蛋白有顯著減少（P<0.05），陽(yáng)性組和10%和5%含藥

7、血清組纖維化肺細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)有減少趨勢(shì)；20%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組肺成纖維細(xì)胞中ERK1/2蛋白有顯著減少（P<0.05），陽(yáng)性組，10%和5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組肺成纖維細(xì)胞中ERK1/2蛋白表達(dá)有減少趨勢(shì)；陽(yáng)性組和不同濃度補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組肺成纖維細(xì)胞中p-ERK蛋白有均減少趨勢(shì)。
　　結(jié)論：⑴采用一次性氣管內(nèi)滴注博萊霉素的方法誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型造模成功。⑵采用組織塊培養(yǎng)法對(duì)肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞分離及培養(yǎng)成功。

8、⑶采用每天1次，連續(xù)給藥7d，采血前禁食12h，于末次灌胃1h后采血的給藥及取血方案制備補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清，其中20%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組在抑制肺纖維化，調(diào)控TGF-β1/Smad/ERK信號(hào)通路中的關(guān)鍵細(xì)胞因子方面，明顯優(yōu)于其他濃度組，提示該血藥濃度可能是適宜的血藥濃度。⑷補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清能夠有效抑制TGF-βl及TGF-βl基因的表達(dá)，并能抑制TGF-β1/Smad/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Smad3、ERK1/2等蛋白的過(guò)度表達(dá)，提