STAT3基因轉染牛乳腺上皮細胞及轉染后細胞的生物學特性觀察.pdf

1、信號轉導及轉錄活化因子(signal and activators of transcription；STAT)是潛在的轉錄因子。在很多人類癌癥和轉化的細胞系中，活性的Stat3是阻礙細胞凋亡、促進細胞轉化所必不可少的因子。近年來人們對Stat3的研究異?；钴S，多項研究結果顯示Star3在多種腫瘤組織與細胞系中異常表達，并與腫瘤的增殖分化、免疫逃避、血管新生、侵襲轉移等密切相關。本試驗將攜帶有Stat3基因的質粒通過脂質體轉染法轉入牛乳

2、腺上皮細胞，并對其生物學特性進行研究，為生產(chǎn)轉基因動物以及牛乳腺上皮細胞的永生化提供研究基礎。 1、采用膠原酶消化法和胰蛋白酶選擇性消化法分離、培養(yǎng)和純化牛乳腺上皮細胞。形態(tài)學觀察表明，培養(yǎng)的細胞具有典型的上皮細胞形態(tài)特征。 2、應用PCR技術從含有人Stat3基因的質粒POTB7中擴增Star3基因。將其克隆入真核表達載體PEGFP-C1中，構建重組表達質粒。 3、用含15％血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牛乳腺上

3、皮細胞，通過脂質體2000將外源基因Stat3轉入牛乳腺上皮細胞，用熒光顯微鏡觀測EGFP的表達，轉染24h后大約16％的細胞被導入含Stat3基因的重組表達質粒用600 μg/mL G418篩選獲得陽性克隆，然后換為含300 μg/mL G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)使陽性克隆得到擴增。 4、獲得的陽性克隆提取RNA，設計特異性引物進行RT-PCR反應，經(jīng)電泳分析在2332bp處出現(xiàn)目的條帶，未轉染的細胞無目的條帶。 5