貝伐單抗緩釋微球構建及其抑制脈絡膜新生血管的實驗研究.pdf

1、實驗目的:構建聚乳酸羥基乙酸(Poly lactic acid-co-glycolic acid，PLGA)聚合物載藥微球，并通過玻璃體腔內注射載藥微球，研究其作為貝伐單抗藥物載體在BN大鼠脈絡膜新生血管疾病(Choroidal neovascularization，CNV)應用的安全性及有效性，旨在提高藥物的生物利用度，減少注射頻率，降低操作相關并發(fā)癥及治療費用，從而提高治療效果。
　　實驗方法:通過噴霧干燥及固/油/水(S/O

2、/W)法制備PLGA-Bevacizumab微球，動態(tài)光散射(Dynamic light scatter，DLS)和掃描電鏡(Scan electronicmicroscope，SEM)分析及觀察微球的粒徑分布及表面形貌;BCA蛋白定量試劑盒檢測微球載藥量;體外釋放實驗考察貝伐單抗從PLGA-Bevacizumab微球中的釋放行為，酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測體

3、外釋放樣品中的Bevacizumab濃度;十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測載藥微球在制備過程中藥物分子有無斷裂或聚合;圓二色譜(Circular dichroism，CD)檢測體外釋放樣品中藥物分子的三級結構的穩(wěn)定性;細胞實驗檢測S/O/W法制備的PLGA-Bevacizumab微球的體外活性。在體實驗

4、，選用80只8-10周成年雄性Brown Norway(BN)大鼠，動物隨機分為3組，實驗組和原藥組用810nm激光誘導雙眼CNV模型，造模1周后，實驗組左眼玻璃體腔內注射5μlPLGA-Bevacizumab微球(O-b)混懸液（實際含藥量78μg）;原藥組左眼玻璃體腔內注射5μl Bevacizumab注射液的生理鹽水稀釋液（實際含藥量78μg）;對照組大鼠不做光凝處理，用來評價材料的生物相容性，左眼玻璃體腔內注射5μlPLGA-B

5、SA微球混懸液作為對照組。每一組動物右眼僅注射5μl生理鹽水作為空白對照。眼底拍照及眼底熒光素鈉血管造影(Fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)觀察CNV造模后光斑處新生血管及其滲漏情況，使用光學相關斷層掃描(Opticalcoherence tomography, OCT)及視網膜電圖(Electroretinogram，ERG)技術檢測視網膜的層次結構及功能變化。在眼內注射后1周、2周、3周和4周，每

6、組隨機選取大鼠處死后摘取眼球行石蠟切片，蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin andeosin staining，HE)觀察組織學改變。分別于術后1周、2周、3周和4周，每組選取3只大鼠，肌肉麻醉后進行心臟采血、前房穿刺抽取房水，處死后摘取眼球，分離視網膜、玻璃體、脈絡膜及鞏膜，用ELISA方法檢測各組織中的貝伐單抗?jié)舛?。通過考察PLGA-Bevacizumab微球在大鼠體內各組織的藥物分布情況，評估載藥微球的體內緩釋效果，通過眼底

7、造影及病理學觀察，評估微球的治療效果。
　　實驗結果:SEM顯示S/O/W法制備的PLGA-Bevacizumab微球O-b尺寸較為均一，平均粒徑為1933.8±64.0nm; BCA蛋白定量試劑盒檢測微球載藥量為10.80％。體外釋放實驗表明微球O-b在12小時內釋放較快，之后持續(xù)緩慢釋放至38天，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)第1天、25天、35天的樣品和貝伐單抗注射液比較，輕鏈和重鏈的分子量未發(fā)生變化;CD結果顯示，和貝伐單抗注射

8、液比較，發(fā)現(xiàn)第1天和25天的分子的三級結構曲線較貝伐單抗輕微降低，但峰形及位置無變化;細胞實驗證實，PLGA-Bevacizumab微球O-b處理組和Bevacizumab注射液處理組的VEGF檢測量較未處理組明顯下降，說明PLGA-Bevacizumab微球O-b能結合VEGF，使游離的VEGF濃度降低。CNV大鼠玻璃體腔注射，實驗組和原藥組，眼內均未觀察到明顯炎癥，和自身對照眼比較，F(xiàn)FA檢查發(fā)現(xiàn)熒光滲漏減弱，OCT檢查表明視網膜結

9、構和厚度逐漸接近正常，HE染色結果示CNV面積縮小，且RPE細胞和感光細胞層結構較為完整，視網膜層次的結構及厚度較接近光凝前，與OCT圖像結果一致。ERG檢測結果表明，實驗組治療眼暗適應最大混合反應b波的平均波幅在注射后2周為354.83μv，較自身對照眼的237.83μv接近基線水平;原藥眼治療眼暗適應最大混合反應b波的平均波幅在注射后2周為408.25μv，較自身對照眼的230.25μv接近基線水平;體內藥物代謝動力學顯示，實驗組治

10、療眼在給藥后2周，視網膜出現(xiàn)最大濃度(Cmax)，為0.45ng/mg，并維持緩慢持續(xù)的釋放，直至4周仍能檢測到微量藥物，其濃度為0.20ng/mg;而原藥組治療眼在給藥后1周，視網膜出現(xiàn)最大濃度(Cmax)，為0.87ng/mg，兩周之后檢測不到藥物濃度。
　　實驗結論:S/O/W法制備的PLGA-Bevacizumab微球O-b體外釋放時間延長到38天;細胞實驗證實載藥微球能與內皮細胞釋放的VEGF結合，降低游離VEGF的濃度