塞來昔布-PLGA緩釋微球抑制實驗性脈絡膜新生血管的研究.pdf

1、目的:脈絡膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)是由多種病因所致的脈絡膜血管芽穿過Bruch膜并在視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)下和/或上增殖形成的纖維血管膜，是老年人群重要的致盲原因之一。研究證明炎癥因素是脈絡膜新生血管重要的發(fā)病機制之一。以往實驗中已證明高選擇性的COX-2抑制劑塞來昔布通過全身給藥抑制BN大鼠(采用激光誘導CNV的動物模型)CNV的形成。由于這些給藥方式，或是難以使藥物進入眼組織，或

2、是操作繁瑣效率低下，或是藥物濃度不能平穩(wěn)的作用于病灶，本實驗制備一種新的藥物劑型塞來昔布-PLGA微球(celecoxib-polylactide-co-glycolidemicrosphere，CEL-PLGA-MS)，觀察其緩釋性和在玻璃體腔注藥后對視網(wǎng)膜的安全性，以達到抑制實驗性脈絡膜新生血管(CNV)的目的。
　　 方法:
　　 1塞來昔布-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球制備。
　　 1.1采用乳化-溶劑揮發(fā)

3、法制備塞來昔布-PLGA微球(CEL-PLGA-MS)。
　　 1.2采用掃描電鏡觀察CEL-PLGA-MS的形態(tài)，粒度分析儀測量其粒徑。
　　 1.3用高效液相色譜法(HPLC)測定CEL-PLGA-MS的載藥量。
　　 1.4采用動態(tài)膜透析法測定CEL-PLGA-MS的體外釋放特性。
　　 1.5標準曲線的制備及回收率和精密度試驗。
　　 2玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球的安全性研究。

4、r>　　 2.1將36只雄性BN大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為3組:CEL-PLGA-MS組16只，分為4個劑量組，分別玻璃體腔注入含celecoxib40μM、80μM、160μM、320μM;celecoxib組16只，分為4個劑量組，分別玻璃體腔注入celecoxib40μM、80μM、160μM、320μM;對照組4只，2只雙眼玻璃體腔注入0.01MPBS溶液，2只雙眼不處理。
　　 2.2藥物配制、消毒和玻璃體腔注藥。<

5、br>　　 2.3注藥后7d、14d、28d用裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡及彩色照相機觀察記錄眼前節(jié)及眼底情況;OCT測量視網(wǎng)膜厚度(距視盤1DD)。
　　 2.4注藥后7天，石蠟切片觀察各組視網(wǎng)膜各層微結(jié)構(gòu)的變化，透射電鏡觀察各組視網(wǎng)膜細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 2.5對實驗結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行析因分析。
　　 3玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球抑制實驗性脈絡膜新生血管的研究。
　　

6、3.1將32只雄性BN大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為4組:CEL-PLGA-MS組8只，雙眼玻璃體腔注入含celecoxib320μM微球;celecoxib組8只，雙眼玻璃體腔注入celecoxib80μM;空白PLGA組8只，雙眼玻璃體腔注入空白PLGA微球;PBS組8只，雙眼玻璃體腔注入0.01MPBS溶液。
　　 3.2氪激光光凝BN大鼠視網(wǎng)膜建立CNV模型。
　　 3.3藥物配制、消毒和玻璃體腔注藥。
　　

7、 3.4造模注藥后14d，熒光素眼底血管造影法(FFA)觀察各組CNV生成情況的不同，光學相干斷層成像術(shù)(OCT)測量各組視網(wǎng)膜脈絡膜纖維血管增生(fibrovascularproliferation，F(xiàn)VP)的厚度不同，病理切片觀察各組FVP結(jié)構(gòu)和厚度的不同。
　　 3.5造模注藥后7d、28d實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法測定各組VEGFmRNA和COX-2mRNA表達的不同
　　 3.6對實驗結(jié)果采用

8、SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析和析因分析。
　　 結(jié)果:
　　 1塞來昔布-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球制備。
　　 1.1掃描電鏡下CEL-PLGA-MS呈球形，大小均勻，表面光滑，分散性好。粒度分析儀測量其粒徑平均為2467.9±18.0nm。
　　 1.2CEL-PLGA-MS平均載藥量為7.77％，體外釋放45d，累積釋放百分率80.91％，緩釋作用明顯。
　　 1.3HPLC測定:

9、在254nm波長下，塞來昔布在1-80μg·ml-1范圍內(nèi)，濃度C(μg·ml-1)與吸光度(A)線性關(guān)系良好?；厥章屎途芏攘己?，精密度RSD小于1％，低、中、高三個濃度的平均回收率為100.07±0.01％，符合測定要求。
　　 2玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球的安全性研究。
　　 2.1裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡檢查所有實驗大鼠在玻璃體腔注藥后各時間點，前節(jié)及玻璃體未見明顯炎性反應。CEL-PLGA-MS組中16

10、0μM劑量組的大鼠有2只眼玻璃體出血。
　　 2.2OCT檢查:注藥后第一周，OCT測量各注藥組視網(wǎng)膜厚度均大于正常對照組(174.20±3.36μm)，但CEL-PLGA-MS組視網(wǎng)膜厚度小于celecoxib組(F=165.15P＜0.01);CEL-PLGA-MS組中除160μM組外，各組視網(wǎng)膜厚度大致相等(F=4.79P＜0.01);celecoxib組中320μM組、160μM組視網(wǎng)膜厚度大于80μM組和40μM組(F

11、=28.10P＜0.01)。注藥后第二周各注藥組視網(wǎng)膜厚度逐漸減小，到第四周CEL-PLGA-MS組視網(wǎng)膜厚度和正常對照組大致相等(F=2.06P＞0.05)，celecoxib組視網(wǎng)膜厚度減小但仍大于正常對照組(F=2.59P＜0.05)。
　　 2.3光鏡下各組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)未見明顯異常，但celecoxib組中320μM組、160μM組神經(jīng)纖維層較對照組明顯增厚，余注藥組輕度增厚，與OCT觀察結(jié)果相同。電鏡下celecoxib

12、組中320μM組、160μM組視網(wǎng)膜毒性反應重，且視網(wǎng)膜內(nèi)層細胞超微結(jié)構(gòu)比外層變化明顯，余各注藥組細胞超微結(jié)構(gòu)變化輕微。
　　 3玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球抑制實驗性脈絡膜新生血管的研究。
　　 3.1造模注藥后14d，OCT圖像中距視盤1.5～2DD，視網(wǎng)膜層間可見梭形高反射信號即為FVP膜。測量的各組FVP平均厚度值中，空白PLGA組和PBS組厚度值大致相等（P＞0.05），并且明顯高于其余兩組(P＜0.01

13、)。CEL-PLGA-MS組FVP平均厚度值低于celecoxib組(P＜0.01)。
　　 3.2FFA晚期圖像(＞10min)，空白PLGA組和PBS組視網(wǎng)膜光凝斑熒光素滲漏明顯，celecoxib組和CEL-PLGA-MS組視網(wǎng)膜光凝斑熒光素無或部分滲漏。
　　 3.3組織病理切片光鏡下視網(wǎng)膜光凝區(qū)中，空白PLGA組和PBS組纖維血管增生程度明顯高于celecoxib組和CEL-PLGA-MS組。各組FVP平均厚度

14、變化與OCT結(jié)果相一致。
　　 3.4RT-PCR測定各組COX-2mRNA中，空白PLGA組和PBS組RQ值沒有明顯差異(P＞0.05)，第一周空白PLGA組和PBS組RQ值明顯高于其余兩組(P＜0.01)，并且CEL-PLGA-MS組高于celecoxib組(P＜0.01)，第四周celecoxib組RQ值明顯高于CEL-PLGA-MS組(P＜0.01)，和PBS組沒有明顯差異(P＞0.05)，但低于空白PLGA組(P＜0.

15、01);測定各組VEGFmRNA中，空白PLGA組和PBS組RQ值沒有明顯差異(P＞0.05)，第一周celecoxib組和CEL-PLGA-MS組RQ值沒有顯著差異(P＞0.05)，但明顯低于空白PLGA組和PBS組(P＜0.01)，第四周celecoxib組RQ值明顯高于CEL-PLGA-MS組(P＜0.01)，但這兩組明顯低于空白PLGA組和PBS組(P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1.制備方法可行，CEL-